Método para la regulación de la traducción de una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una proteína en una célula,

en el que la célula es una célula vegetal, fúngica, bacteriana, animal o de mamífero no humana, y que incluye las etapas de: a) proporcionar un constructo de ácidos nucleicos con una primera secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 50% de identidad de secuencia de nucleótidos con la secuencia de nucleótidos de la SEC. ID. Nº: 1, operativamente vinculado a dicha segunda secuencia de nucleótidos que codifica una proteína y, además, está operativamente vinculado a un promotor, b) poner en contacto una célula con dicho constructo de ácidos nucleicos para obtener una célula transformada, y c) someter dicha célula transformada a condiciones que llevan a la expresión de la proteína.

Antecedentes de la invención

La reproducción sexual en plantas y animales requiere la producción de gametos. Aunque hay muchas

ºº diferencias citológicas en las fases de desarrollo de los gametos entre el reino animal y el vegetal, se dan varias similitudes. Tanto en los vegetales como en los animales, la producción de gametos es un proceso muy ordenado que se caracteriza por las transiciones de las células madre de un estado fisiológico al siguiente mediante divisiones meióticas y mitóticas. Esta serie de transiciones está dirigida por cambios múltiples en la expresión genética. Varias fases del desarrollo de gametos en diferentes especies vegetales y animales se llevan a cabo casi sin actividad

ººº transcripcional. En estas fases, los ARNm previamente sintetizados se traducen en productos que son esenciales para que el desarrollo pueda continuar. Esto implica que, en estas especies, el control postranscripcional de la expresión genética es el principio fundamental del desarrollo de los gametos. Un ejemplo de regulación postranscripcional de expresión genética durante el desarrollo de gametos es la maduración y germinación de los gametofitos masculinos (polen) en las plantas angiospermas. El polen inmaduro consiste en una célula generativa

ººº pequeña y una célula vegetativa grande que se forman a partir de microesporas mediante una mitosis haploide asimétrica (mitosis de polen I). En las fases posteriores del desarrollo, algunas especies tienen una segunda mitosis haploide (mitosis de polen II) que da como resultado polen tricelular, un proceso ausente en la mayoría de especies (es decir, polen bicelular). La maduración de este polen bi y tricelular se completa mediante una serie de procesos de desarrollo que produce la deshidratación progresiva del polen y su transición a la dormancia. La maduración de

ººº polen de diferentes especies de vegetales viene acompañada de una acumulación de grandes cantidades de ARNr, ARNt, ARNm y ribosomas. En cuanto el polen aterriza en un estigma compatible, se da una rehidratación considerable del grano de polen. Esto lleva a una rápida reactivación de los mecanismos de traducción, que usan los ARNt, ARNr y ARNm previamente acumulados. Las proteínas que se sintetizan a partir de estos productos almacenados son necesarias para la fase progámica del polen, es decir, para la germinación del polen, el

ººº crecimiento posterior del tubo de polen y la segunda mitosis haploide en el caso del polen bicelular.

A pesar de la importancia de los procesos postranscripcionales que regulan la expresión genética del polen, se sabe poco sobre los mecanismos subyacentes a la regulación postranscripcional de la expresión genética del polen. Tan sólo hay un estudio en la técnica que se centra en la regulación traduccional de un gen expresado de polen (lat52) (Bate et al., (1996) Plant J., 10(4), 613-623). En este estudio, se demuestra la implicación del 5' UTR en

ººº la regulación de la traducción específica del polen. Más en general, en el ritmo de traducción influyen los elementos en cis de los ARNm. Por ejemplo, el nivel de traducción de especies de ARNm a partir de distintos sistemas eucarióticos es modulado por elementos en cis del 5' UTR, la secuencia codificante o el 3' UTR. Estos elementos en cis actúan influyendo en la estabilidad del ARNm, en la iniciación de la traducción o en su alargamiento.

La regulación de la síntesis de la proteína del polen del tabaco NTP303 se desarrolla a nivel

ººº postranscripcional. Las transcripciones del gen ntp303 se pueden detectar por primera vez tras la mitosis I del polen y continúan acumulándose durante la maduración del polen y el posterior crecimiento del tubo del polen (Weterings et al., (1992) Plant Mol. Biol. 18(6), 1101-1111). En cambio, la proteína sólo aparece en cantidades detectables cuando comienza la rehidratación del polen (Wittink et al., (2000) Sex. Plant Reprod. 12(5), 276-284). Así, a pesar de la acumulación de su ARNm, no se da una síntesis eficaz de la proteína NTP303 durante el desarrollo del polen,

ººº cuya restricción sólo se alivia al comenzar la germinación del polen. Sin embargo, no está claro qué elementos en cis del ARNm de npt303, si los hay, son los responsables de este mecanismo de regulación traduccional. En concreto, no está claro si cualquiera de esos elementos podría ser usado para regular la expresión de proteínas además de la NPT303, como, por ejemplo, las proteínas heterólogas.

Descripción de la invención

ººº Definiciones

A continuación, se muestran las definiciones de los términos tal y como se usan en la invención.

Planta

Como se utiliza aquí, el término "planta" hace referencia bien a una planta entera, incluyendo en general la clase de plantas más altas susceptibles a técnicas de transformación, incluyendo tanto plantas monocotiledóneas

ººº como dicotiledóneas, o bien una parte de una planta, como, por ejemplo, raíces, tallos, hojas, pétalos, frutos, semillas, tubérculos, polen, meristemas, callos, sépalos, bulbos y flores. El término planta, como se utiliza aquí, también hace referencia, sin limitaciones, a células vegetales en semillas, cultivos de suspensión, embriones, regiones meristemáticas, tejidos de callo, hojas, raíces, brotes, tejido gametofítico y esporofítico, polen, protoplastos y microesporas. Además, todos los tejidos de las plantas en todos los órganos están incluídos en la definición del

ººº término planta como se utiliza aquí. Los tejidos de planta incluyen, pero no se limitan a, tejidos diferenciados e indiferenciados de una planta, incluyendo polen, tubos de polen, granos de polen, raíces, brotes, brotes de meristemas, nodos coleoptilares, napas, hojas, pétalos cotiledóneos, óvulos, tubérculos, semillas y granos. Los tejidos de las plantas pueden estar en la planta, o en un órgano, tejido o cultivo celular. Como se utiliza aquí, las plantas monocotiledóneas hacen referencia a una planta cuyas semillas tienen sólo un cotiledón, u órgano del

ººº embrión que almacena y absorbe el alimento. Como se utiliza en este caso, las plantas dicotiledóneas hacen

referencia a una planta cuyas semillas tienen dos cotiledones. Las plantas incluidas en la invención son todas plantas susceptibles de transformación.

Operativamente vinculado

Como se utiliza aquí, el término "operativamente vinculado" hace referencia a dos o más elementos de una

ºº secuencia de ácido nucleico que están físicamente vinculados y que tienen una relación funcional entre sí. Por ejemplo, un promotor está operativamente vinculado a una secuencia codificante si el promotor es capaz de iniciar o regular la transcripción o expresión de esa secuencia codificante, en cuyo caso, debería entenderse que la secuencia está "bajo el control" del promotor. Generalmente, cuando dos secuencias de ácidos nucleicos están operativamente vinculadas, éstas tendrán la misma orientación y normalmente también estarán en el mismo marco

ººº de lectura. Normalmente serán esencialmente contiguas, aunque podría no ser necesario.

Promotor

Como se utiliza aquí, el término "promotor" hace referencia a un fragmento de ácido nucleico que funciona para controlar la transcripción de uno o más genes, localizado hacia arriba con respecto a la dirección de transcripción del sitio de iniciación de la transcripción del gen, y se identifica estructuralmente por la presencia de un

ººº sitio de unión para la ARN-polimerasa dependiente de ADN, sitios de iniciación de la transcripción y otras secuencias de ADN, incluyendo, pero sin limitarse a, sitios de unión del factor de transcripción, sitios de unión de proteínas activadoras y represoras, así como otras secuencias de nucleótidos conocidas por un experto en la técnica, para actuar directa o indirectamente en la regulación de la cantidad de transcripción del promotor.

Hibridación de ortólogos de ácido nucleico e hibridación del 5' UTR

ººº [0008] Toda secuencia de nucleótidos capaz de hibridar con las secuencias de nucleótidos de la SEC. ID. Nº. 1 se define como parte del 5' UTR de la invención. Las condiciones de hibridación rigurosas se definen aquí como condiciones que permiten que una secuencia de ácidos nucleicos de al menos 25 nucleótidos, aunque preferiblemente de 50, 75 ó 100, y más preferiblemente de 150 o más, hibride a una temperatura de aproximadamente 65°C en una solución que contiene aproximadamente 1 M de sal, preferiblemente... [Seguir leyendo]

1. Método para la regulación de la traducción de una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una proteína en una célula, en el que la célula es una célula vegetal, fúngica, bacteriana, animal o de mamífero no humana, y que incluye las etapas de:

ºº a) proporcionar un constructo de ácidos nucleicos con una primera secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 50% de identidad de secuencia de nucleótidos con la secuencia de nucleótidos de la SEC. ID. Nº: 1, operativamente vinculado a dicha segunda secuencia de nucleótidos que codifica una proteína y, además, está operativamente vinculado a un promotor,

b) poner en contacto una célula con dicho constructo de ácidos nucleicos para obtener una célula

ººº transformada, y

c) someter dicha célula transformada a condiciones que llevan a la expresión de la proteína.

2. Método para la regulación de la traducción de una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una proteína en una célula, en el que la célula es una célula vegetal, fúngica, bacteriana, animal o de mamífero no humana, y que incluye las etapas de:

ººº a) proporcionar un constructo de ácidos nucleicos con una primera secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 50% de identidad de secuencia de nucleótidos con los nucleótidos 104 - 151 de la secuencia de nucleótidos de la SEC. ID. Nº: 1, o una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 55 % de identidad de secuencia de nucleótidos con los nucleótidos 4 - 76 de la secuencia de nucleótidos de la SEC. ID. Nº: 1, o una combinación de los

ººº mismos, operativamente vinculado a dicha segunda secuencia de nucleótidos que codifica una proteína, y además está operativamente vinculado a un promotor,

b) poner en contacto una célula con dicho constructo de ácidos nucleicos para obtener una célula transformada, y

c) someter dicha célula transformada a condiciones que llevan a la expresión de la proteína.

ººº 3. Método según la reivindicación 2, en el que la primera secuencia de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 50% de identidad de secuencia de nucleótidos con los nucleótidos 104 - 151 de la secuencia de nucleótidos de la SEC. ID. Nº: 1 o una secuencia de nucleótidos que tiene un 100% de identidad de secuencia de nucleótidos con los nucleótidos 27 - 50 de la secuencia de nucleótidos de la SEC. ID. Nº: 1 o una combinación de la misma.

ººº 4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la proteína es una proteína heteróloga.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la proteína se expresa en una célula vegetal transgénica homocigota doble haploide de Nicotiana tabacum silenciada para ntp303.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la proteína se expresa en el polen o la semilla de dicha planta.

ººº 7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la primera secuencia de nucleótidos comprende la secuencia de nucleótidos 104 - 151 de la secuencia de nucleótidos de la SEC. ID. Nº: 1.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la primera secuencia de nucleótidos comprende la secuencia de nucleótidos 4 - 76 de la secuencia de nucleótidos de la SEC. ID. Nº: 1.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la secuencia de nucleótidos comprende la

ººº secuencia de nucleótidos 27 - 50 de la secuencia de nucleótidos de la SEC. ID. Nº: 1.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la primera secuencia de nucleótidos comprende la secuencia de la SEC. ID. Nº:1.

11. Planta que es una planta de Nicotiana tabacum transgénica, homocigótica, doble haploide y silenciada para ntp303, en donde dicha planta comprende un constructo de ácidos nucleicos con una primera secuencia de

ººº nucleótidos que tiene al menos un 50% de identidad de secuencia de nucleótidos con la secuencia de nucleótidos de la SEC. ID. Nº: 1, operativamente vinculada a una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una proteína.

12. Planta que es una planta de Nicotiana tabacum transgénica, homocigótia, doble haploide y silenciada para ntp303, en donde dicha planta comprende un constructo de ácidos nucleicos con una primera secuencia de

ººº nucleótidos que tiene al menos un 50% de identidad de secuencia de nucleótidos con los nucleótidos 104 - 151 de la secuencia de nucleótidos de la SEC. ID. Nº: 1, o una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 55% de identidad de secuencia de nucleótidos con los nucleótidos 4 - 76 de la secuencia de nucleótidos de la SEC. ID. Nº: 1, o una combinación de las mismas, operativamente vinculada a una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una proteína.

ººº 13. Planta según la reivindicación 12, donde la primera secuencia de nucleótidos comprende una secuencia de

nucleótidos que tiene al menos un 50% identidad de secuencia de nucleótidos con los nucleótidos 104 - 151 de la secuencia de nucleótidos de la SEC. ID. Nº: 1, o una secuencia de nucleótidos que tiene un 100% de identidad de secuencia de nucleótidos con los nucleótidos 27 - 50 de la secuencia de nucleótidos de la SEC. ID. Nº: 1 o una combinación de las mismas.

ºº 14. Planta según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en donde la segunda secuencia de nucleótidos codifica una proteína heteróloga.

15. Material de propagación de una planta según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14.

16. Material de cosecha de una planta según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14.

17. Tejido de una planta según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14.

ººº 18. Constructo de ácido nucleico con una primera secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 50 % de identidad de secuencia de nucleótidos con la secuencia de nucleótidos de la SEC. ID. Nº: 1, operativamente vinculado a una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una proteína.

19. Constructo de ácido nucleico según la reivindicación 18, en el que la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína es posteriormente se vincula operativamente a un promotor.

ººº 20. Constructo de ácido nucleico según las reivindicaciones 18 y 19, en el que la primera secuencia de nucleótidos comprende la secuencia de SEC. ID. Nº:1.

21. Célula huésped recombinante animal no humano, mamífero no humano, vegetal, bacteriana o fúngica con una o más copias del constructo de ácidos nucleicos tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 18 a

20.

ººº 22. Uso de la primera secuencia de nucleótidos tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para la expresión de una proteína y, opcionalmente, para la recuperación de la proteína expresada.

23. Uso según la reivindicación 22, en el que la primera secuencia de nucleótidos se usa en una célula vegetal, fúngica, bacteriana, animal o de mamífero no humana.

24. Uso según la reivindicación 23, en el que una primera secuencia de nucleótidos se usa en un sistema de

ººº traducción acelular utilizando ARNs derivados de un constructo de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 18-20.