PRODUCCIÓN RECOMBINANTE DE MEZCLAS DE ANTICUERPOS.

La presente invención se refiere al campo de la medicina, más particularmente al campo de la producción de anticuerpos, más particularmente a la producción de mezclas de anticuerpos. Antecedentes de la invención La función esencial del sistema inmunológico es la defensa contra infecciones. El sistema inmunológico humoral combate las moléculas reconocidas como no propias, tales como los patógenos, usando inmunoglobulinas. Estas inmunoglobulinas, también denominadas anticuerpos, son generadas específicamente contra el agente infeccioso, que actúa como un antígeno, después del primer contacto (Roitt, Essential Inmunology, Blackwell Scientific Publications, quinta edición, 1984). Los anticuerpos son moléculas multivalentes que comprenden cadenas pesadas (H) y cadenas livianas (L) unidas con enlaces disulfuro intercatenarios. Se conocen varios isotipos de anticuerpos, incluyendo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgD, IgE e IgM. Una IgG contiene dos cadenas pesadas y dos cadenas livianas. Cada cadena contiene regiones constantes (C) y variables (V), que pueden ser subdivididas en dominios denominados CH1, CH2, CH3, VH, y CL, VL (Fig. 1). El anticuerpo se liga al antígeno a través de los dominios de la región variable contenidos en la porción Fab, y después de la ligadura puede interactuar con moléculas y células del sistema inmunológico a través de los dominios constantes, principalmente a través de la porción Fc. Los linfocitos B pueden producir anticuerpos en respuesta a la exposición a sustancias biológicas tales como bacterias, virus y sus productos tóxicos. Los anticuerpos son generalmente específicos para los epitopos y se unen fuertemente a sustancias que llevan estos epitopos. La técnica del hibridoma (Kohler y Milstein 1975) aprovecha la capacidad de las células B para producir anticuerpos monoclonales a antígenos específicos y para producir subsiguientemente estos anticuerpos monoclonales fusionando las células B de ratones expuestos al antígeno de interés a células plasmáticas murinas inmortalizadas. Esta tecnología dio por resultado el reconocimiento de que los anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas podrían ser usados en investigación, diagnóstico y terapias para tratar diferentes tipos de enfermedades, tales como cáncer y trastornos de tipo autoinmune. Como los anticuerpos que son producidos en el hibridoma del ratón inducen fuertes respuestas inmunológicas en los seres humanos, se ha apreciado en el arte que los anticuerpos requeridos para un tratamiento exitoso en los seres humanos necesitaban ser menos, o preferentemente no, inmunogénicos. Para ello, se generaron primero por ingeniería genética anticuerpos murinos reemplazando las regiones constantes murinas con regiones constantes humanas (denominados anticuerpos quiméricos). Subsiguientemente, los dominios entre las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) en los dominios variables, las así llamadas regiones marco, fueron reemplazadas por sus contrapartidas humanas (denominados anticuerpos humanizados). La etapa final en este procedimiento de humanización ha sido la producción de anticuerpos completamente humanos. En el arte también se han descrito anticuerpos biespecíficos, que tienen especificidades de ligadura para dos antígenos diferentes. Estos se usan generalmente para ser direccionados a una parte terapéutica o de diagnóstico, por ejemplo, célula T, una molécula disparadora citotóxica o un quelante que liga un radionúclido, que es reconocido por una región variable del anticuerpo a una célula que es reconocida por la otra región variable del anticuerpo, por ejemplo, una célula tumoral (ver, para anticuerpos biespecíficos, Segal et al, 2001). Un método muy útil conocido en la técnica para obtener anticuerpos monoclonales completamente humanos con propiedades de ligadura deseables emplea bibliotecas de presentación de fagos. Esta es una propuesta in vitro, basada en ADN recombinante, que simula las características clave de la respuesta inmunológica humoral (ver, para métodos de presentación de fagos, por ejemplo, CF Barbas III et al, Phage Display. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 2001). Para la construcción de las bibliotecas de presentación de fagos, se expresan colecciones de genes de la región variable de la cadena pesada y liviana de los anticuerpos monoclonales humanos en la superficie de partículas de bacteriófagos, usualmente en formato Fab o Fv de cadena simple (scFv). Las bibliotecas grandes de fagos que expresan fragmentos de anticuerpos contienen típicamente más de 10 9 especificidades de anticuerpos y pueden ser combinados de las regiones V de inmunoglobulinas expresadas en los linfocitos B de individuos inmunizados o no inmunizados. Alternativamente, las bibliotecas de presentación de fagos pueden ser construidas a partir de regiones variables de inmunoglobulinas que han sido ensambladas o reordenadas parcialmente in vitro para introducir una diversidad adicional de anticuerpos en la biblioteca (bibliotecas semisintéticas) (De Kruif et al, 1995b). Por ejemplo, las regiones variables reunidas in vitro contienen tramos de ADN aleatorizado o parcialmente aleatorizado, producido sintéticamente en aquellas regiones de las moléculas que son importantes para la especificidad del anticuerpo. La información genética que codifica los anticuerpos identificados por presentación en fagos, se puede usar para la clonación de anticuerpos en un formato deseado, por ejemplo, IgG, IgA o IgM, para producir el anticuerpo con métodos de ADN recombinantes (Boel et al, 2000). Un método alternativo para proveer anticuerpos completamente humanos usa ratones transgénicos que comprenden material genético que codifica un repertorio de inmunoglobulina humana (Fishwild et al, 1996; Méndez et al, 1997). 2   Tales ratones pueden ser inmunizados con un antígeno objetivo, y la respuesta inmunológica resultante producirá anticuerpos completamente humanos. Las secuencias de estos anticuerpos se pueden usar en métodos de producción recombinantes. La producción de anticuerpos monoclonales en forma rutinaria se realiza mediante el uso de la expresión recombinante de las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las cadenas H y L de anticuerpos en células huésped (ver, por ejemplo, EP0120694; EP0314161; EP0481790; patente U.S. 4.816.567; WO 00/63403). Hasta la fecha, muchas enfermedades diferentes están siendo tratadas con anticuerpos monoclonales humanizados o completamente humanos. Los productos basados en anticuerpos monoclonales que están aprobados actualmente para el uso en seres humanos incluyen Herceptin (anti-Her2/Neu), Reopro (receptor anti-glicoproteína IIB/IIIA), Mylotarg (anti-CD33), Rituxan (Rituximab, anti-CD20), Simulect (anti-CD25), Remicade (anti-TNF), Synagis (anti-RSV), Zenapax (receptor IL2), CAMPATH (anti-CD52). A pesar de estos éxitos, hay lugar aún para nuevos productos de anticuerpos y para una mejora considerable de productos de anticuerpos existentes. El uso de anticuerpos monoclonales en el tratamiento del cáncer ha mostrado que pueden surgir las así llamadas variantes tumorales con pérdida del antígeno", haciendo que el tratamiento con el anticuerpo monoclonal sea menos efectivo. El tratamiento con el anticuerpo monoclonal muy exitoso Rituximab (anti-CD20) ha mostrado, por ejemplo, que pueden ocurrir variantes que escapan a la pérdida del antígeno, llevando a una recaída del linfoma (Massengale et al, 2002). En el arte, la potencia de los anticuerpos monoclonales se ha aumentado fusionándolos a compuestos tóxicos, tales como los radionúclidos, toxinas, citoquinas, y similares. Cada una de estas propuestas, sin embargo, tienen sus limitaciones, incluyendo problemas tecnológicos y de producción y/o alta toxicidad. Además, parece que la ganancia en especificidad de los anticuerpos monoclonales en comparación con los anticuerpos policlonales indefinidos tradicionales, se produce a costo de la pérdida de eficacia. In vivo, las respuestas de los anticuerpos son de naturaleza policlonal, es decir, se produce una mezcla de anticuerpos porque varias células B responden al antígeno, dando por resultado que varias especificidades estén presentes en la mezcla de anticuerpo policlonal. Los anticuerpos policlonales también pueden ser usados para aplicaciones terapéuticas, por ejemplo, para vacunación pasiva o para inmunoterapia activa, y actualmente se derivan usualmente de suero combinado de animales inmunizados o de seres humanos que se recuperaron de la enfermedad. El suero combinado es purificado en la fracción proteinácea o de gammaglobulina, así llamadas porque contiene predominantemente moléculas de IgG. Los anticuerpos policlonales que se usan actualmente para tratamiento incluyen anticuerpos policlonales anti-rhesus, gammaglobulina para... [Seguir leyendo]

1. Un método para la producción de una mezcla de anticuerpos en un huésped recombinante, que comprende las etapas de: expresar en una célula huésped recombinante una secuencia de ácidos nucleicos o secuencias de ácidos nucleicos que codifican una cadena liviana común y al menos tres diferentes cadenas pesadas que son capaces de aparearse con una cadena liviana común. 2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, que también comprende la etapa de: recuperar los anticuerpos de la célula huésped o el cultivo de células huésped. 3. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde al menos dos anticuerpos que comprenden un dímero de cadena pesada-liviana en dicha mezcla de anticuerpos tienen diferentes especificidades y/o afinidades. 4. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dicha célula huésped recombinante es capaz de expresión de alto nivel de proteínas recombinantes sin la necesidad de amplificación del ácido nucleico que codifica dichas proteínas en dicha célula. 5. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde dicha célula se deriva de una célula retiniana embriónica humana que fue inmortalizada o transformada por secuencias adenovirales E 1. 6. Un método de acuerdo con la reivindicación 5, en donde dicha célula huésped se deriva de una célula PER.C6. 7. Una mezcla de al menos tres anticuerpos recombinantes diferentes, en donde dichos al menos tres diferentes anticuerpos tienen una cadena liviana común, en donde al menos tres diferentes cadenas pesadas están representadas en dicha mezcla que se puede obtener por medio de un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6. 8. Una mezcla de acuerdo con la reivindicación 7, en donde los anticuerpos presentes en dicha mezcla se unen con diferentes epitopos del mismo antígeno y/o con diferentes antígenos presentes en una mezcla que comprende antígeno. 9. Una mezcla de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, en donde dicha mezcla comprende un anticuerpo biespecífico. 10. Una mezcla de acuerdo con la reivindicación 7, 8 ó 9, en donde dichas cadenas pesadas difieren en sus regiones constantes de modo suficiente como para reducir el apareamiento entre las diferentes cadenas pesadas. 11. Una célula huésped recombinante que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una cadena liviana y secuencias de ácidos nucleicos que codifican al menos tres diferentes cadenas pesadas de un anticuerpo, en donde dichas cadenas liviana y pesada son capaces de aparearse. 12. Una composición farmacéutica que comprende una mezcla de anticuerpos producidos de modo recombinante de acuerdo con la reivindicación 7 y un portador apropiado, 13. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 12, en donde dicha mezcla de anticuerpos fue producida por células huésped recombinantes de acuerdo con la reivindicación 9. 14. Una composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12-13, en donde al menos dos de dichos anticuerpos tienen diferentes especificidades. 15. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 14, en donde dichas diferentes especificidades se refieren a diferentes epitopos en el mismo antígeno. 16. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 14, en donde dichas diferentes especificidades se refieren a diferentes antígenos presentes en una mezcla que comprende antígeno. 17. Una composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12-13, en donde al menos dos de dichos anticuerpos tienen diferentes afinidades por el mismo epitopo. 18. Una composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12-17, en donde dicha composición tiene un efecto que es mayor que el efecto de cada anticuerpo individual presente en dicha composición, en donde dicho efecto se mide en un ensayo funcional. 19. Un método para preparar una célula huésped recombinante para la producción de una mezcla de anticuerpos, que comprende las etapas de: introducir en dicha célula huésped una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una cadena liviana y secuencias de ácidos nucleicos que codifican al menos tres diferentes cadenas pesadas que son capaces de aparearse con 59   dicha cadena liviana, en donde dichas secuencias de ácidos nucleicos se introducen de forma consecutiva o concomitante. 20. Un método para preparar una célula huésped recombinante para la producción de una mezcla de anticuerpos, que comprende la etapa de: introducir secuencias de ácidos nucleicos que codifican al menos tres diferentes cadenas pesadas en una célula huésped recombinante que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una cadena liviana capaz de aparearse con al menos tres de dichas cadenas pesadas. 21. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, o una célula huésped recombinante de acuerdo con la reivindicación 9, o un método de preparación de una célula huésped recombinante de acuerdo con la reivindicación 19 ó 20, en donde la secuencia de ácidos nucleicos o secuencias que codifican al menos una de dichas cadenas livianas y/o pesadas fueron obtenidas por medio de un método que comprende al menos una etapa de selección de muestra de anticuerpos. 22. Un cultivo de células huésped recombinantes de acuerdo con la reivindicación 9, que producen una mezcla de anticuerpos a partir de una célula individual dentro de la célula, donde dicha mezcla comprende al menos una cadena liviana y al menos tres diferentes cadenas pesadas. 23. Un cultivo de acuerdo con la reivindicación 22, en donde dicho cultivo produce dicha mezcla de anticuerpos a partir de una célula individual dentro del cultivo para más de 20 duplicaciones de población.   61   62   63   64     66   67   68   69     71   72   73   74     76   77   78   79     81   82   83   84     86   87   88   89     91   92   93