Un procedimiento para preparar un adyuvante de emulsión de aceite en agua,

que comprende las etapas de: (a) purificar escualeno a partir de una levadura que produce un alto rendimiento de escualeno durante el cultivo, en el que la levadura se crece en un medio controlado libre de productos de origen animal; y (b) combinar el escualeno purificado en la etapa (a) con un componente acuoso para formar el adyuvante de emulsión de aceite en agua.

Campo Técnico

La presente invención es en el campo de la fabricación de escualeno para su uso en adyuvantes de emulsión de aceite en agua.

Técnica Anterior

El aceite de hígado de tiburón contiene un terpenoide instaurado llamado escualeno, 2,6,10,15,19,23-hexametil2,6,10,14,18,22-tetracosahexaeno. Se conoce el escualeno para su uso en emulsiones de aceite en agua en vacunas humanas, por ejemplo la emulsión MF59 que se utiliza para adyuvar vacunas de la gripe. El escualeno también es usado en otros productos farmacéuticos (por ejemplo, ungüentos, supositorios) y en cosméticos.

Las fuentes actuales del escualeno son, principalmente, aceites de pescado y, en particular, aceites de hígado de tiburón. Puede haber problemas asociados con el uso de escualeno extraído a partir de aceite de hígado de tiburón, particularmente si los estándares de fabricación rigurosos (tales como aquellos utilizados durante la producción de MF59 por Novartis) no se mantienen. Por ejemplo, los tiburones pueden estar infestados por patógenos que son también infecciosos para los humanos o que producen sustancias que son nocivas para los humanos, y pueden existir agentes de tiburón de EET o tipo EET [por ejemplo, referencias 1-3]. Además, los tiburones puede contener toxinas humanas, tales como la toxina carcha. Por lo tanto, las fuentes de escualeno baratas de baja calidad no son adecuadas para uso farmacéutico humano. El riesgo de daño a un receptor humano puede elevarse en situaciones en las que el escualeno es parte de un adyuvante inmunológico porque, por definición, el adyuvante puede inducir una fuerte respuesta inmune no deseada frente a la impureza.

En lugar de usar fuentes de escualeno derivado de tiburones baratas de baja calidad, por lo tanto, los usos farmacéuticos del escualeno (por ejemplo, como se utiliza en la fabricación de MF59) emplean un material de mayor calidad, pero estos escualenos de alta calidad son caros y de disponibilidad limitada. Tales fuentes caras no son útiles, por ejemplo, para su uso en el mundo en desarrollo.

Sería útil encontrar una fuente de escualeno que cumpla estos altos estándares farmacéuticos sin ser tan caro. Es por tanto deseable una fuente de escualeno alternativa viable, particularmente cuando el escualeno está destinado para su uso en un adyuvante inmunológico. Una fuente más barata de escualeno de grado farmacéutico sería particularmente útil en países en desarrollo que o bien no tienen fácil acceso a tiburones o bien no pueden permitirse fácilmente el caro material de grado farmacéutico utilizado actualmente, por ejemplo, por Novartis. Una posible fuente son las levaduras [5, 37, 38].

Divulgación de la invención

La invención se refiere a procedimientos para la preparación de escualeno a partir de levaduras que hiperproducen escualeno. Las levaduras son organismos GRAS (generalmente considerados como de uso seguro) y como tales son una fuente útil de escualeno para uso farmacéutico. Además, el escualeno puede prepararse libre de contaminación por patógenos, priones y toxinas ambientales; por ejemplo las levaduras están, a priori, libres de mercurio. En el campo de las vacunas ya se usan las levaduras (por ejemplo, para la expresión recombinante del antígeno de superficie del virus de la hepatitis B) y por lo tanto no suponen ninguna preocupación regulatoria particular, es decir, el escualeno derivado de levaduras es especialmente adecuado para su uso en la preparación de adyuvantes inmunológicos. Finalmente, las técnicas de cultivo de levaduras están generalizadas y son fácilmente adaptables a la tecnología de transferencia.

La invención proporciona un procedimiento para preparar un adyuvante de emulsión de aceite en agua, que comprende las etapas de: (a) purificar escualeno a partir de una levadura que produce un alto rendimiento de escualeno durante el cultivo; y (b) combinar el escualeno purificado de la etapa (a) con un componente acuoso para formar la emulsión de aceite en agua. La invención también proporciona un procedimiento para preparar un adyuvante de emulsión de aceite en agua, que comprende las etapas de:

(a) obtener escualeno que se ha purificado a partir de una levadura que produce un alto rendimiento de escualeno durante el cultivo; y

(b) combinar el escualeno de la etapa (a) con un componente acuoso para formar la emulsión de aceite en agua. Las levaduras se crecen en medios controlados libre de productos de origen animal.

La invención también proporciona un procedimiento para preparar una composición inmunogénica (por ejemplo, una vacuna), que comprende preparar una emulsión de aceite en agua como se describe anteriormente, y mezclar la emulsión con un inmunógeno.

La invención también proporciona un procedimiento para preparar un kit para la preparación de una composición inmunogénica de esta forma, que comprende preparar una emulsión de aceite en agua como se describe anteriormente, envasar la composición en un primer contenedor, y combinar el primer recipiente en forma de kit con un segundo contenedor, en el que el segundo contenedor contiene un inmunógeno. El inmunógeno puede estar en forma seca o acuosa.

Producción de escualeno en levadura

La invención utiliza escualeno que se ha purificado a partir de levadura. Las levaduras pueden ser cepas naturales o mutantes que se seleccionan por un alto rendimiento de escualeno, pero generalmente serán cepas genéticamente modificadas que han sido manipuladas para producir altos rendimientos de escualeno. Otra posibilidad es cultivar cepas de levaduras naturales, mutantes o modificadas en presencia de factores que dan como resultado un aumento del rendimiento de escualeno.

El rendimiento de escualeno puede expresarse como un % del peso seco celular (cdw) en un levadura particular. Una cepa normal de levadura silvestre Yarrowia lipolytica típicamente puede producir escualeno aproximadamente al 0,5% cdw, mientras que una levadura de cerveza normal Saccharomyces uvarum puede producir escualeno aproximadamente al 1,4% cdw [4]. Una levadura que produce un "alto rendimiento" de escualeno es una en la que al menos un 2% cdw es escualeno, por ejemplo. ≥ 3%, ≥ 4%, ≥ 5%, ≥ 6%, ≥ 7%, ≥ 8%, ≥ 9%, ≥ 10%, ≥ 11%, ≥ 12%, ≥ 13%, ≥ 14%, ≥ 15% o más de cdw.

El rendimiento de escualeno también puede expresarse como un% de los lípidos totales en un levadura particular. Una levadura de la cerveza normal S.uvarum produce escualeno al 33% de los lípidos totales [4]. Una levadura que produce un "alto rendimiento" de escualeno puede producir escualeno a >40% de los lípidos totales, por ejemplo. >50%, >60%, etc.

De forma ventajosa, el escualeno está, al menos el 95%, en su configuración trans (isoforma natural), por ejemplo. >96%, >97%, >98%, >99%, o 100%.

Las cepas de levadura mutantes naturales que tienen un alto rendimiento de escualeno son conocidas en la técnica, por ejemplo la cepa Torulasopra delbrueckii descrita en la referencia 5. Los mutantes puede obtenerse por procedimientos bien conocidos de inducir mutaciones (bien mutagénesis aleatoria o dirigida), por ejemplo los descritos en las referencias 6 y 7, seguidos del cribado de las células que han sufrido mutagénesis para seleccionar aquellas con un alto rendimiento de escualeno adecuado. La referencia 8 describe cepas de levadura mutantes con mutaciones sensibles a temperatura de la 4-α-carboxiesterol-C3-deshidrogenasa (ERG26) que provoca la acumulación de escualeno cuando se crecen a una temperatura apropiada.

No obstante, normalmente la invención usará levaduras genéticamente modificadas. Pueden utilizarse diversos procedimientos para incrementar el rendimiento de escualeno de una cepa de partida. El metabolismo de los esteroles puede manipularse para aumentar los rendimientos de escualeno, por ejemplo aumentando el anabolismo del escualeno, y/o disminuyendo el catabolismo del escualeno (incluyendo su degradación y/o su conversión natural a ergosterol). Los genes implicados en la biosíntesis de escualeno incluyen mevalonato cinasa, fosfomevalonato cinasa, pirofosfomevalonato descarboxilasa, isopentenil pirofosfato isomerasa, HMGR (3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA reductasa), y escualeno sintasa. Los genes implicados en la conversión de escualeno a ergosterol incluyen escualeno epoxidasa (ERG1), lanosterol sintasa, C14-dimetilasa, d14-reductasa, C4-metiloxidasa, C4-descarboxilasa (ERG26), 3-cetorreductasa, C24-metiltransferasa, C8-isomerasa, C5-desaturasa,... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para preparar un adyuvante de emulsión de aceite en agua, que comprende las etapas de:

(a) purificar escualeno a partir de una levadura que produce un alto rendimiento de escualeno durante el cultivo, en el que la levadura se crece en un medio controlado libre de productos de origen animal; y

(b) combinar el escualeno purificado en la etapa (a) con un componente acuoso para formar el adyuvante de emulsión de aceite en agua.

2. Un procedimiento para preparar un adyuvante de emulsión de aceite en agua, que comprende las etapas de:

(a) obtener escualeno que se ha purificado a partir de una levadura que produce un alto rendimiento de escualeno durante el cultivo, en el que la levadura se crece en un medio controlado libre de productos de origen animal; y

(b) combinar el escualeno de la etapa (a) con un componente acuoso para formar el adyuvante de emulsión de aceite en agua.

3. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la levadura produce escualeno a ≥ 5% de peso seco celular.

4. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la levadura es una Saccharomyces, tal como S. cerevisiae.

5. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la levadura expresa una enzima HMGR truncada que tiene una localización citosólica.

6. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la levadura es una cepa modificada que, con respecto a una cepa madre no modificada, hiperexpresa HMGR.

7. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la levadura es una cepa modificada que, con respecto a una cepa madre no modificada, infraexpresa la cimosterol-24-metiltransferasa y/o la ergosta-5,7,24(28)-trienol-22-deshidrogenasa.

8. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la levadura expresa una oxidoescualeno ciclasa mutante.

9. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la levadura tiene una escualeno epoxidasa alterada.

10. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la levadura se crece en presencia de factores que aumentan el rendimiento de escualeno durante el cultivo, por ejemplo en el que el factor es alilamina, voriconazol, 6-amino-2-n-pentiltiobenzotiazol, tiamina, o un tiocarbamato.

11. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la levadura se crece en condiciones parcial o totalmente anaeróbicas antes de la purificación del escualeno.

12. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el escualeno tiene una pureza mayor del 97% (en peso).

13. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que la emulsión de aceite en agua tiene gotitas de aceite con un diámetro submicrométrico, en el que la emulsión de aceite en agua es una emulsión microfluidizada, y/o en el que la emulsión de aceite en agua comprende escualeno y polisorbato 80.

14. Un procedimiento para preparar una vacuna para uso por vía parenteral en seres humanos, que comprende una etapa de preparación de un adyuvante de emulsión de aceite en agua por el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, y la mezcla del adyuvante de emulsión con un inmunógeno.

15. Un procedimiento para preparar un kit para la preparación de una composición inmunogénica, que comprende preparar una emulsión de aceite en agua mediante el el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, envasar la emulsión en un primer contenedor, y combinar el primer contenedor en forma de kit con un segundo contenedor, en el que el segundo contenedor contiene un inmunógeno.