Procedimiento de realización de un inmunoanálisis in vitro mediado por células que comprende:

(i) almacenar una muestra de sangre completa extraída de un individuo durante al menos 6 horas in vitro, (ii) purificar una población de células que contienen linfocitos T y células presentadoras de antígenos (CPA) de granulocitos que están presentes en dicha muestra almacenada, mediante un procedimiento que incorpora una etapa de selección por afinidad negativa para eliminar granulocitos o una etapa de selección por afinidad positiva utilizando ligandos que se unen a proteínas de la superficie celular presentes en la superficie de linfocitos T y de las CPA unidas a un soporte sólido para separar dicha población de granulocitos; y (iii) utilizar dicha población de células en un inmunoanálisis mediado por células, para medir las repuestas de la citocina específica para el antígeno en linfocitos T.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a los procedimientos para el almacenamiento y purificación de las células de una muestra de sangre completa. En particular, la invención se refiere a los procedimientos para el almacenamiento y purificación de las células de las muestras de sangre completa, de tal manera que una población de linfocitos y células presentadoras de antígeno se estabiliza y purifica eficazmente para su utilización en ensayos que miden la respuesta inmunitaria in vitro mediada por células.

Antecedentes de la invención

Las respuestas inmunitarias mediadas por células (IMC) se utilizan normalmente para definir el estado inmunitario de un individuo. Por lo general, en la técnica de la inmunología clínica, el término respuesta IMC incluye pruebas cutáneas in vivo, ensayos de proliferación de linfocitos y la detección in vitro de citocinas producidas por las células mononucleares de la sangre periférica (CMSP) en presencia de un antígeno específico. La invención descrita en este documento estudia procedimientos mejorados de manipulación, estabilización y preparación de las células procedentes de muestras aisladas de sangre completa para su utilización en técnicas de ensayo diseñadas para medir una clase de respuestas IMC, a saber, la respuesta IMC in vitro basada en citocinas a un antígeno específico (denominado en adelante "ensayo IMC").

Las células del sistema inmunológico son capaces de producir moléculas efectoras inmunitarias como las citocinas tras la estimulación por un antígeno. Los ensayos IMC implican la incubación de una muestra de células con un antígeno y la medición de la presencia o cantidad de una molécula efectoras inmunes, tales como una citocina para proporcionar una indicación de la capacidad del individuo para generar una respuesta inmunitaria mediada por células con el antígeno seleccionado. Células para su utilización en un ensayo IMC también incluyen poblaciones aisladas de linfocitos (linfocitos T en concreto) y células presentadoras de antígeno (CPA). Las CPA están involucradas en el tratamiento del antígeno a fin de que estos últimos pueden ser reconocidos por los receptores de linfocitos T en la superficie de cada linfocito T. Citocinas inducidas por antígenos pueden ser liberadas en el medio de ensayo y detectarse de manera directa, por ejemplo, por los procedimientos de ELISA, o cuantificarse en términos de la frecuencia de linfocitos T secretores de citocinas utilizando procedimientos ELISPOT.

El ensayo en filtro inmunoplaca, denominado también ensayo inmunomancha con enzima ligada (ELISPOT), fue desarrollado inicialmente para detectar y cuantificar linfocitos B secretores de anticuerpos. Por el momento se desarrolló, la técnica proporcionó una alternativa rápida y versátil a los ensayos convencionales con células formadoras de placas.Modificaciones recientes han mejorado la sensibilidad de la ELISPOT de tal manera que pueden detectarse células productoras de tan sólo 100 moléculas de una proteína específica por segundo. Estos ensayos se aprovechan de la concentración relativamente alta de un producto celular proteico dado (por ejemplo, una citocina) en el entorno inmediato que rodea las células secretoras de proteínas. Estos productos celulares son capturados y detectados utilizando anticuerpos de alta afinidad. El ensayo ELISPOT se revisa en Current Protocols in Immunology, Unidad 6.19 páginas 6.19 1-8.

El ensayo ELISPOT por lo general involucra seis etapas: (1) recubrimiento de un anticuerpo específico para una citocina purificada a una placa de microvaloración respaldada con membrana; (2) bloqueo de la placa para evitar la absorción inespecífica de otras proteínas; (3) incubación de las células secretoras de citocinas con reactivos apropiados; (4) eliminación de células y reactivos, (5) adición de un segundo anticuerpo anticitocina marcado, y (6) detección del complejo anticuerpo-citocina en la membrana.

Los procedimientos actuales para preparar células a partir de una muestra de sangre para su utilización en un ensayo IMC implican el aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (CMSP), utilizando un gradiente de Ficoll. De acuerdo con estos procedimientos, con el fin de ser eficaces en el ensayo IMC, los linfocitos y las CPA deben purificarse en la muestra de sangre completa tan pronto como sea posible, y en particular dentro de las 8 horas de la recogida de la muestra de sangre de un individuo.

Meier et al., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2005: 529-536 expone la sensibilidad del ensayo ELSPOT para el diagnóstico de la tuberculosis. Peters et al. Methods in Molecular Biology, vol. 302, 2005, Handbook of ELISPOT: Methods and Protocols, págs. 95-115 expone los procedimientos para el aislamiento de subconjuntos de inmunocitos para análisis utilizando ensayos ELISPOT. El documento US 2003/0185817 da a conocer procedimientos de separación de células utilizando inmunorrosetas de células nucleadas y de glóbulos rojos.

Sumario de la invención

Los presentes inventores han identificado los procedimientos de almacenamiento y purificación de las células de una muestra de sangre completa para su utilización en inmunoanálisis mediados por células (ensayos IMC), tal como un ensayo ELISPOT. También se identifican los procedimientos para el tratamiento de muestras de sangre completa antes de su almacenamiento. Estos procedimientos permiten almacenar muestras de sangre completa durante, por ejemplo, por lo menos 6 horas, tal como hasta 48 horas antes de su utilización en un ensayo IMC, tal como un ensayo ELISPOT.

De acuerdo con la presente invención, se proporciona un procedimiento de realización de un inmunoanálisis in vitro mediado por células que comprende:

(I) almacenar una muestra de sangre completa extraída de un individuo durante al menos 6 horas in vitro,

(II) purificar una población de células que contienen linfocitos T y células presentadoras de antígenos (CPA) de granulocitos que están presentes en dicha muestra almacenada, mediante un procedimiento que incorpora una etapa de selección por afinidad negativa para eliminar granulocitos o una etapa de selección por afinidad positiva utilizando ligandos que se unen a proteínas de la superficie celular presentes en la superficie de linfocitos T y de las CPA unidas a un soporte sólido para separar dicha población de granulocitos; y

(III) utilizar dicha población de células en un inmunoanálisis mediado por células, para medir las repuestas de la citocina específica para el antígeno en linfocitos T.

un procedimiento de tratamiento y almacenamiento de una muestra de sangre completa que comprende el tratamiento de dicha muestra de sangre completa por dilución con el medio de crecimiento; y el almacenamiento de la muestra de sangre completa tratada de al menos 6 horas, en la que después del almacenamiento una población de linfocitos y CPA pueden obtenerse de la muestra para su utilización en un ensayo IMC. Después del almacenamiento, las CMSP o una preparación adecuada de los linfocitos y las CPA pueden aislarse de la muestra de sangre completa diluida para su utilización en un ensayo IMC, tal como un ensayo ELISPOT.

Los inventores describen además un procedimiento para mantener la respuesta de los linfocitos T aislados a citocinas específicas para péptidos procedentes de una muestra de sangre completa en un ensayo ELISPOT, que comprende la separación de una población de células que comprenden linfocitos T y las CPA de dicha muestra de sangre completa utilizando una selección por afinidad positiva o negativa.

Los inventores describen además un procedimiento de preparación de linfocitos y las CPA adecuadas para su utilización en un ensayo ELISPOT, en el que dicho procedimiento comprende la eliminación de los glóbulos rojos de la sangre por filtración.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona un procedimiento para almacenar y purificar las células de una muestra de sangre completa para su utilización en un ensayo IMC como un ensayo ELISPOT. Los inventores describen también un procedimiento de tratamiento de una muestra de sangre completa por dilución con un medio de crecimiento de las células y el almacenamiento de la muestra de sangre completa tratada. Los procedimientos permiten que la respuesta a las citocinas específicas para péptidos de los linfocitos aislados y de las CPA de dicha muestra de sangre sea suficiente para su utilización en un ensayo IMC, tal como un ensayo ELISPOT, y preferentemente que sea útil... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de realización de un inmunoanálisis in vitro mediado por células que comprende:

(i) almacenar una muestra de sangre completa extraída de un individuo durante al menos 6 horas in vitro,

(ii) purificar una población de células que contienen linfocitos T y células presentadoras de antígenos (CPA) de granulocitos que están presentes en dicha muestra almacenada, mediante un procedimiento que incorpora una etapa de selección por afinidad negativa para eliminar granulocitos o una etapa de selección por afinidad positiva utilizando ligandos que se unen a proteínas de la superficie celular presentes en la superficie de linfocitos T y de las CPA unidas a un soporte sólido para separar dicha población de granulocitos; y

(iii) utilizar dicha población de células en un inmunoanálisis mediado por células, para medir las repuestas de la citocina específica para el antígeno en linfocitos T.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha muestra se almacena durante al menos 10 horas o al menos 12 horas, u opcionalmente entre 12 y 36 horas o 24 y 48 horas.

3. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que dicha muestra se almacena entre 2 y 8ºC o entre 18 y 25ºC.

4. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha etapa (ii) del procedimiento comprende una etapa de selección por afinidad negativa para eliminar granulocitos, en el que la muestra se pone en contacto con una preparación de anticuerpos que contiene anticuerpos anti-CD66b y glicoforina A. Los anticuerpos sirven para aglomerar glóbulos rojos y granulocitos, y dichos glóbulos rojos y granulocitos se eliminan de la preparación por centrifugación.

5. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha etapa (ii) del procedimiento comprende eliminar granulocitos poniendo en contacto dicha muestra con un soporte sólido anti-CD15 para eliminar las células CD15+ de la muestra, en el que opcionalmente dicho soporte sólido comprende bolitas magnéticas y en el que opcionalmente el procedimiento comprende poner en contacto la muestra con las bolitas magnéticas para unir las células CD15+ a las bolitas, y separar las bolitas que tienen las células CD15+ unidas a las mismas de la muestra.

6. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que los glóbulos rojos en la muestra se eliminan por lisis o por filtración, antes de la etapa (iii).

7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la purificación conduce a un aumento en la muestra tanto de la relación de linfocitos T a las células totales y de la relación de células presentadoras de antígenos a células totales ; y/o en el que la muestra no está congelada en ningún punto antes del almacenamiento, purificación o utilización en dicho inmunoanálisis mediado por células.

8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la etapa (ii) comprende una etapa de selección por afinidad positiva para dichas células, en el que opcionalmente la etapa de selección por afinidad selecciona todos los tipos de linfocitos T.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que la etapa (ii) comprende poner en contacto dicha muestra con un soporte sólido que tiene unido al mismo ligandos que se unen a las proteínas de la superficie celular presentes en la superficie de dichos linfocitos T y células presentadoras de antígenos para de este modo aislar la preparación de linfocitos T y células presentadoras de antígenos, en el que opcionalmente:

- dicho soporte sólido comprende uno o más ligandos anti-CD4, anti-CD8, anti-CD19 y anti-CD14 para aislar células CD4+, CD8+, CD19+ y/o CD14+ de la muestra de sangre completa, y/o -dicha preparación de linfocitos T y células presentadoras de antígenos se separan del soporte sólido antes de su utilización en la etapa (iii), y/o -dicha preparación de linfocitos T y células presentadoras de antígenos son retenidas en dicho soporte sólido para su utilización en la etapa (iii), y/o -dicho soporte sólido comprende bolitas magnéticas, en el que opcionalmente cada una de dichas bolitas tiene unido a la misma un ligando anti-CD4, anti-CD8 y anti-CD19, y preferentemente cada bolita magnética tiene unido a la misma uno o más anti-CD4, anti-CD8 y anti-CD19, y dichas bolitas magnéticas se mezclan para proporcionar el soporte sólido que se une a las células CD4+, CD8+ y CD19+.

10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el inmunoanálisis mediado por células es un análisis ELISPOT.

11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores que se lleva a cabo en una muestra de un ser humano, opcionalmente en el que la muestra se utiliza en un inmunoanálisis mediado por células para diagnosticar una enfermedad.