PROCEDIMIENTO DE FABRICACIÓN DE VACUNAS.

La presente invención se refiere a procedimientos mejorados para llevar a cabo las reacciones de condensación de carbodiimida. En particular, se refiere a la conjugación de sacáridos y proteínas mediante condensación de carbodiimida. También se refiere a composiciones inmunogénicas que se pueden producir que comprenden los conjugados de sacáridos y proteínas de la invención. El uso de polisacáridos capsulares bacterianos ha sido ampliamente utilizado en inmunología durante muchos años para la prevención de enfermedades bacterianas. Un problema con dicho uso, sin embargo, es la naturaleza independiente de células T de la respuesta inmune. Estos antígenos son muy poco inmunogénicos en niños pequeños. Este problema ha sido superado por medio de la conjugación de los antígenos de polisacáridos a una proteína vehículo (una fuente de epítopos para células T ayudantes) que puede entonces utilizarse para provocar una respuesta inmunitaria dependiente de células T, incluso en el primer año de vida. En la técnica se conocen diversas técnicas de conjugación. Los conjugados también se pueden preparar mediante procedimientos de aminación reductora directa como se describe en los documentos US 4365170 (Jennings) y US 4673574 (Anderson). En los documentos EP-0-161-188, EP-208375 y EP-0-477508 se describen otros procedimientos. El procedimiento de conjugación puede depender de la activación de los grupos hidroxilo del sacárido con tetrafluoroborato de 1-ciano-4-dimetilamino piridinio (CDAP) para formar un éster de cianato. Así el sacárido activado se puede acoplar directamente o a través de un grupo espaciador (conector) a un grupo amino en la proteína vehículo. Por ejemplo, el éster de cianato se puede acoplar con hexanodiamina o dihidrazida de ácido adípico (ADH o AH) y el sacárido derivado con un grupo amino se conjuga a la proteína vehículo usando química de la carbodiimida (por ejemplo, EDAC o EDC) a través de un grupo carboxilo en la proteína vehículo. Esos conjugados se describen en la solicitud PCT publicada WO 93/15760 de la Universidad de Servicios Uniformados y en los documentos WO 95/08348 y WO 96/29094. Véase también Chu C. y col. Infect. Immunity, 1983, 245-256. El documento WO 99/18121 describe un procedimiento para unir polisacáridos a moléculas de proteínas de manera covalente. En general, pueden usarse los siguientes tipos de grupos químicos en una proteína vehículo para acoplamiento / conjugación: A) Carboxilo (por ejemplo, a través de ácido aspártico o ácido glutámico) que puede ser conjugado a grupos amino naturales o derivados en restos sacárido por medio de química de la carbodiimida; B) Grupo amino (por ejemplo, a través de lisina) que puede ser conjugado a grupos carboxilo naturales o derivados en restos sacárido por medio de química de la carbodiimida; C) Sulfhidrilo (por ejemplo, a través de cisteína); D) Grupo hidroxilo (por ejemplo, a través de tirosina); E) Grupo imidazolilo (por ejemplo, a través de histidina); F) Grupo guanidilo (por ejemplo, a través de arginina); y G) Grupo indolilo (por ejemplo, a través de triptófano). En un sacárido, en general pueden utilizarse los siguientes grupos para un acoplamiento: OH, COOH o NH2. Los grupos aldehído pueden generarse tras utilizar diferentes tratamientos conocidos en la técnica, tales como: peryodato, hidrólisis ácida, peróxido de hidrógeno, etc. Enfoques de acoplamiento directo: ES 2 367 918 T3 Sacárido-OH + CNBr o CDAP -----> éster de cianato + NH2-Prot ----> conjugado sacárido-aldehído + NH2-Prot ----> base de Schiff + NaCNBH3 ----> conjugado sacárido-COOH + NH2-Prot + EDAC ----> conjugado sacárido-NH2 + COOH-Prot + EDAC ----> conjugado Enfoques de acoplamiento indirecto por medio de un espaciador (conector) Sacárido-OH + CNBr o CDAP ---> éster de cianato + NH2----NH2 ----> sacárido-NH2 + COOH-Prot + EDAC -----> conjugado Sacárido-OH + CNBr o CDAP ----> éster de cianato + NH2-----SH -----> sacárido----SH + SH-Prot (proteína nativa con una cisteína expuesta u obtenida tras la derivación de grupos amino de la proteína por SPDP, por ejemplo) -----> sacárido-S-S-Prot 2 Sacárido-OH + CNBr o CDAP ---> éster de cianato + NH2----SH -------> sacárido----SH + maleimida-Prot (derivación de grupos amino) ----> conjugado Sacárido-COOH + EDAC + NH2-----NH2 ---> sacárido------NH2 + EDAC + COOH-Prot ----> conjugado Sacárido-COOH + EDAC+ NH2----SH -----> sacárido----SH + SH-Prot (proteína nativa con una cisteína expuesta u obtenida tras la derivación de grupos amino de la proteína por SPDP, por ejemplo) -----> sacárido-S-S-Prot Sacárido-COOH + EDAC+ NH2----SH -----> sacárido----SH + maleimida-Prot (derivación de grupos amino)----> conjugado Sacárido-aldehído + NH2-----NH2 ----> sacárido---NH2 + EDAC + COOH-Prot ----> conjugado Como puede observarse, la de química de la carbodiimida (por ejemplo, utilizando EDAC) es muy conveniente para las reacciones de conjugación, ya que hace uso de grupos en los sacáridos y/o proteínas que pueden estar presentes de manera natural o pueden ser fácilmente insertados por derivación. También une de manera conveniente restos a través de un enlace peptídico. Las carbodiimidas (RN=C=NR) son compuestos insaturados con una estructura de aleno (Nakajima and Ikada, 1995, Bioconjugate Chem. 6: 123-130; Hoare and Koshland, 1967, JBC 242: 2447-2453). El compuesto químico es relativamente inestable en su pH de reacción (4,5-6,5), y por lo tanto, en la técnica se suelen añadir todos los componentes de la reacción de conjugación de sacárido/proteína juntos. Los presentes inventores han encontrado que, dependiendo de la naturaleza del sacárido y la proteína a conjugar, se pueden lograr mejores características del conjugado final para el uso en vacunas mediante la adición lenta de un componente determinado de la reacción a la mezcla. Al hacerlo pueden obtenerse una o más ventajas y mejoras: rendimiento del sacárido en el conjugado, filtrabilidad estéril del conjugado, mejor control de la conjugación, mayor facilidad de reproducibilidad, y/o prevención de la formación de enlaces de reticulación intra-resto. Por consiguiente, en una forma de realización se proporciona un procedimiento para generar una composición inmunogénica que comprende conjugar un sacárido a una proteína vehículo mediante química de condensación de la carbodiimida, en el que el sacárido comprende (por ejemplo, como parte de su unidad de repetición), o ha sido derivado para comprender, grupos amino y/o carboxilo, y en el que la proteína vehículo comprende, o ha sido derivada para comprender, grupos amino y/o carboxilo, que comprende las etapas de: I) - Si la proteína vehículo comprende tanto grupos amino como carboxilo y el sacárido comprende grupos amino o carboxilo: a) mezclar el sacárido y la alícuota de carbodiimida necesaria para llevar a cabo la conjugación, y b) añadir la alícuota de proteína vehículo necesaria durante un período de 1 minuto a 6 horas, en el que al menos una cuarta parte de la alícuota se añade durante la primera mitad del período y al menos una cuarta parte de la alícuota en la segunda mitad del período; II) - Si el sacárido comprende tanto amino grupos como carboxilo y la proteína vehículo comprende grupos amino o carboxilo: a) mezclar la proteína vehículo y la alícuota de carbodiimida necesaria para llevar a cabo la conjugación, y b) añadir la alícuota de sacárido necesaria durante un período de 1 minuto a 6 horas, en el que al menos una cuarta parte de la alícuota se añade durante la primera mitad del período y al menos una cuarta parte de la alícuota en la segunda mitad del período; III) - Si el sacárido comprende tanto grupos amino como carboxilo y la proteína vehículo comprende tanto grupos amino como carboxilo: a) mezclar la proteína vehículo y el sacárido, y b) añadir la alícuota de carbodiimida necesaria para llevar a cabo la conjugación en un período de 1 minuto a 6 horas, en el que al menos una cuarta parte de la alícuota se añade durante la primera mitad del período y al menos una cuarta parte de la alícuota en la segunda mitad del período; y en el que: ES 2 367 918 T3 la alícuota de carbodiimida es de 0,01 a 3 mg de carbodiimida por mg de sacárido; el sacárido está presente en una concentración final de 0,5-50 mg/ml en la etapa b); la proteína vehículo está presente en una concentración final de 1-50 mg/ml en la etapa b); 3 la proporción inicial de proteína vehículo a sacárido es de 5:1 a 1:5 (p:p); la concentración de sal presente en la etapa b) es de 0-2 M; el pH de la reacción en la etapa b) es de pH: 4,5-6,5, o pH: 4,5-7,5 si en la etapa b) está presente un compuesto que mantiene el intermedio de reacción estable; y la temperatura de la reacción en la etapa b) es de 4-37 ºC. Descripción detallada ES 2 367 918 T3 Se puede utilizar... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para generar una composición inmunogénica que comprende conjugar un sacárido a una proteína vehículo mediante química de condensación de la carbodiimida, en el que el sacárido comprende (por ejemplo, como parte de su unidad de repetición), o ha sido derivado para comprender, grupos amino y/o carboxilo, y en el que la proteína vehículo comprende, o ha sido derivada para comprender, grupos amino y/o carboxilo, que comprende las etapas de: I) - Si la proteína vehículo comprende tanto grupos amino como carboxilo y el sacárido comprende grupos amino o carboxilo: a) mezclar el sacárido y la alícuota de carbodiimida necesaria para llevar a cabo la conjugación, y b) añadir la alícuota de proteína vehículo necesaria durante un período de 1 minuto a 6 horas, en el que al menos una cuarta parte de la alícuota se añade durante la primera mitad del período y al menos una cuarta parte de la alícuota en la segunda mitad del período; II) - Si el sacárido comprende tanto amino grupos como carboxilo y la proteína vehículo comprende grupos amino o carboxilo: a) mezclar la proteína vehículo y la alícuota de carbodiimida necesaria para llevar a cabo la conjugación, y b) añadir la alícuota de sacárido necesaria durante un período de 1 minuto a 6 horas, en el que al menos una cuarta parte de la alícuota se añade durante la primera mitad del período y al menos una cuarta parte de la alícuota en la segunda mitad del período; III) - Si el sacárido comprende tanto grupos amino como carboxilo y la proteína vehículo comprende tanto grupos amino como carboxilo: a) mezclar la proteína vehículo y el sacárido, y b) añadir la alícuota de carbodiimida necesaria para llevar a cabo la conjugación en un período de 1 minuto a 6 horas, en el que al menos una cuarta parte de la alícuota se añade durante la primera mitad del período y al menos una cuarta parte de la alícuota en la segunda mitad del período; y en el que: ES 2 367 918 T3 la alícuota de carbodiimida es de 0,01 a 3 mg de carbodiimida por mg de sacárido; el sacárido está presente en una concentración final de 0,5-50 mg/ml en la etapa b); la proteína vehículo está presente en una concentración final de 1-50 mg/ml en la etapa b); la proporción inicial de proteína vehículo a sacárido es de 5:1 a 1:5 (p:p); la concentración de sal presente en la etapa b) es de 0-2 M; el pH de la reacción en la etapa b) es de pH: 4,5-6,5, o pH: 4,5-7,5 si en la etapa b) está presente un compuesto que mantiene el intermedio de reacción estable; y la temperatura de la reacción en la etapa b) es de 4-37 ºC. 2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que en la etapa b) el período es de 1 minuto a 4 horas, de 2 minutos a 3 horas, de 3 minutos a 2 horas, de 4 a 60 minutos, de 5 a 50 minutos, de 6 a 40 minutos, de 7 a 30 minutos o de 8 a 20 minutos. 3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que en la etapa b) el período es de 1 minuto a 5 horas, de 10 minutos a 4 horas, de 20 minutos a 3 horas, de 30 minutos a 2 horas, de 40 a 90 minutos o de 50 a 70 minutos. 4. El procedimiento de las reivindicaciones 1-3, en el que la carbodiimida es EDAC (1-etil-3-(3-dimetil-aminopropil) carbodiimida) o una carbodiimida diferente de EDAC. 5. El procedimiento de las reivindicaciones 1-4, en el que la alícuota de carbodiimida necesaria para llevar a cabo la conjugación es de 0,05 a 2 o de 0,09 a 1 mg/mg de sacárido. 6. El procedimiento de las reivindicaciones 1-5, en el que el sacárido y/o la proteína vehículo se han derivado para comprender grupos amino o carboxilo. 21 ES 2 367 918 T3 7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que la derivación es a través de la adición de un conector hetero- u homo-bifuncional. 8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que el conector tiene entre 4 y 12 átomos de carbono. 9. El procedimiento de la reivindicación 7 u 8, en el que el conector tiene dos grupos reactivos amino. 10. La composición inmunogénica de las reivindicaciones 7-9, en la que el conector es ADH. 11. El procedimiento de la reivindicación 7 u 8, en el que el conector tiene dos grupos reactivos ácido carboxílico. 12. El procedimiento de la reivindicación 7 u 8, en el que el conector tiene un grupo reactivo amino en un extremo y un grupo reactivo ácido carboxílico en el otro extremo. 13. El procedimiento de las reivindicaciones 7-12, en el que la derivación tiene lugar a través de la reacción de un gran exceso de conector con el sacárido y/o la proteína vehículo a derivar. 14. El procedimiento de las reivindicaciones 7-13, en el que el sacárido comprende un grupo reactivo hidroxilo como parte de su unidad de repetición que se deriva parcialmente a través de un grupo amino del conector. 15. El procedimiento de la reivindicación 14, en el que el sacárido se deriva parcialmente con la química del CDAP. 16. El procedimiento de las reivindicaciones 7-13, en el que el sacárido comprende un grupo reactivo amino como parte de su unidad de repetición que se deriva parcialmente a través de un grupo carboxilo del conector. 17. El procedimiento de la reivindicación 16, en el que el sacárido se deriva parcialmente con la química de condensación de la carbodiimida. 18. El procedimiento de las reivindicaciones 7-13, en el que el sacárido comprende un grupo reactivo carboxilo como parte de su unidad de repetición que se deriva parcialmente a través de un grupo amino del conector. 19. El procedimiento de la reivindicación 18, en el que el sacárido se deriva parcialmente con la química de la carbodiimida. 20. El procedimiento de las reivindicaciones 1-19, en el que en la etapa b) la alícuota de carbodiimida, sacárido o proteína vehículo se añade a una velocidad constante por medio de una bomba. 21. El procedimiento de las reivindicaciones 1-19, en el que en la etapa b) la alícuota de carbodiimida, sacárido o proteína vehículo se añade en etapas durante el período. 22. El procedimiento de la reivindicación 21, en el que al menos una cuarta parte de la alícuota se añade durante la primera mitad del período y al menos una cuarta parte de la alícuota durante la segunda mitad del período. 23. El procedimiento de la reivindicación 21 o 22, en el que la alícuota a se añade en 4-100 etapas e. 24. El procedimiento de la reivindicación 23, en el que se añade a/e de la alícuota en cada etapa. 25. El procedimiento de la reivindicación 23 o 24, en el que si una etapa tiene lugar en el tiempo cero del período p, cada etapa posterior tiene lugar en un tiempo que es p/(e-1). 26. El procedimiento de las reivindicaciones 1-25, en el que la relación inicial de proteína vehículo a sacárido es de 4:1 a 1:1 o de 3:1 a 2:1 (p/p). 27. El procedimiento de las reivindicaciones 1-26, en el que la concentración de sal, por ejemplo NaCl, presente en la etapa b) es de 0,1-1 o 0,2-0,5 M. 28. El procedimiento de las reivindicaciones 1-27, en el que el pH de la reacción en la etapa b) se mantiene en pH 4,7-6,0 o 5-5,5. 29. El procedimiento de las reivindicaciones 1-27, en el que N-hidroxisuccinimida también está presente en la reacción en la etapa b), y el pH de la reacción en la etapa b) se mantiene en pH 4,5-7,5. 30. El procedimiento de las reivindicaciones 1-29, en el que la temperatura de la reacción en la etapa b) se mantiene en 10-32, 17-30 o 22-27 °C. 31. El procedimiento de las reivindicaciones 1-30, en el que después de que se ha añadido toda la alícuota en la etapa b) la reacción se mantiene durante otros 10 minutos a 72 horas, 20 minutos a 48 horas, 30 minutos a 24 horas, 40 minutos a 12 horas, 50 minutos a 6 horas o 1-3 horas. 22 ES 2 367 918 T3 32. El procedimiento de las reivindicaciones 1-31, en el que una vez que la reacción se ha completado, el pH se ajusta a 7,5-9. 33. El procedimiento de las reivindicaciones 1-32, que comprende una etapa c) posterior, en la que el conjugado de sacárido-proteína se purifica en una columna de cromatografía de exclusión por tamaños. 34. El procedimiento de las reivindicaciones 1-33, que comprende una etapa d) posterior, en la que el conjugado de sacárido-proteína se esteriliza por filtración. 35. El procedimiento de las reivindicaciones 1-34, que comprende una etapa e) posterior, en la que se formula una dosis eficaz del conjugado de sacárido-proteína con un excipiente farmacéuticamente aceptable para fabricar una composición inmunogénica o vacuna. 36. El procedimiento de las reivindicaciones 1-35, en el que el sacárido es un sacárido capsular bacteriano, por ejemplo procedente de una bacteria seleccionada de una lista que consiste en: N. meningitidis serogrupos A, B, C, W135 o Y, Streptococcus pneumoniae serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F o 33F, Grupo B de Streptococcus grupos Ia, Ib, II, III, IV, V, VI o VII, Staphylococcus aureus tipo 5, Staphylococcus aureus tipo 8, Salmonella typhi (sacárido Vi), Vibrio cholerae o H. influenzae tipo b. 37. El procedimiento de las reivindicaciones 1-36, en el que el peso molecular promedio en peso del sacárido es de 1000-2000000, 5000-1000000, 10000-500000, 50000-400000, 75000-300000 o 100000-200000. 38. El procedimiento de las reivindicaciones 1-37, en el que el sacárido es un polisacárido nativo o está clasificado por tamaño por un factor no mayor a x10 (por ejemplo por microfluidización). 39. El procedimiento de las reivindicaciones 1-35, en el que el sacárido es un lipooligosacárido o lipopolisacárido bacteriano, por ejemplo procedente de una bacteria seleccionada de una lista que consiste en: N. meningitidis, H. influenzae, E. coli, Salmonella o M. catarrhalis. 40. El procedimiento de las reivindicaciones 1-39, en el que la proteína vehículo comprende uno o más epítopos de células T ayudantes. 41. El procedimiento de las reivindicaciones 1-40, en el que la proteína vehículo se selecciona del grupo que consiste en: TT, DT, CRM197, fragmento C d TT, proteína D de H. influenzae, PhtD del neumococo y neumolisina del neumococo. 42. Una composición inmunogénica o vacuna que puede obtenerse por el procedimiento de las reivindicaciones 1- 41, en el que el sacárido es un sacárido capsular bacteriano procedente de una bacteria seleccionada de una lista que consiste en: N. meningitidis serogrupo A, B, C, W135 o Y, Streptococcus pneumoniae serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F o 33F, Grupo B de Streptococcus grupos Ia, Ib, II, III, IV, V, VI o VII, Staphylococcus aureus tipo 5, Staphylococcus aureus tipo 8, Salmonella typhi (sacárido Vi) o Vibrio cholerae, o en el que el sacárido es un lipooligosacárido o lipopolisacárido bacteriano procedente de una bacteria seleccionada de una lista que consiste en: N. meningitidis, H. influenzae, E. coli, Salmonella o M. catarrhalis, y en el que se formula una dosis eficaz del conjugado de sacárido-proteína con un excipiente farmacéuticamente aceptable. 43. Uso de la composición inmunogénica o vacuna de la reivindicación 42 en la fabricación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de enfermedad. 44. El uso de la reivindicación 43, en el que la enfermedad está causada por una bacteria seleccionada de una lista que consiste en: N. meningitidis, Streptococcus pneumoniae, M. catarrhalis, Grupo B de Streptococcus, Staphylococcus aureus, Salmonella typhi, Vibrio cholerae, E. coli y H. influenzae. 23