PROCEDIMIENTO DE CRIBADO.

Un procedimiento para detectar una variante de proteína conocida en una muestra que comprende:

(i) digerir la proteína para producir una serie definida de péptidos; (ii) ionizar los péptidos y seleccionar por espectrometría de masas una especie ionizada de relación masa/carga conocida indicativa de la variante de proteína; caracterizado por (iii) someter la especie ionizada seleccionada a disociación inducida por colisión y medir una o más de las especies ionizadas derivadas de relación masa/carga conocida que confirman la presencia de la variante de proteína en la muestra

La presente invención se refiere a un procedimiento para cribar péptidos variantes usando espectrometría de masas (EM). La presente invención también se refiere a un sistema y a un kit para realizar el procedimiento.

La espectrometría de masas ha demostrado ser una herramienta muy valiosa para la determinación de estructuras moleculares de moléculas de muchos tipos que incluyen biomoléculas y, hoy en día se pone en práctica generalizadamente. La técnica implica el bombardeo de la especie molecular en examen con electrones u otras partículas de alta energía que producen la ionización y la fragmentación de la molécula, produciendo un amplio espectro de partículas ionizadas de carga y masa variables. Las técnicas de ionización suave tales como la electropulverización producen la ionización, pero no producen principalmente la fragmentación de moléculas. La técnica es particularmente valiosa en la producción de especies múltiplemente cargadas de proteínas y péptidos. Los complejos espectros masa/carga producidos se convierten, como se pone en práctica convencionalmente, en un espectro desconvolucionado generado por ordenador que tiene un único pico de masa para cada polipéptido. Los desarrollos actuales de la espectrometría de masas se han centrado ampliamente en desarrollar el software más eficaz necesario para el análisis de desconvoluciones. Sin embargo, a pesar de continuar las mejoras en esta parte de la técnica, éste sigue siendo el componente más exigente y que requiere mucho tiempo del procedimiento para cada determinación particular. El uso del análisis de desconvoluciones se ha convertido en indispensable en la espectrometría de masas que tiene como objetivo las elucidación de estructuras moleculares previamente desconocidas o inciertas, pero demostró que era difícil simplificar la metodología actual para reducir significativamente el tiempo requerido para su realización.

La espectrometría de masas también se usa para la detección de proteínas y polipéptidos variantes que participan en enfermedades graves. Por ejemplo, se sabe que muchas formas variantes o mutantes de las subunidades del polipéptido de hemoglobina producen diversas formas de anemia, y muchas de tales mutaciones son de sólo un aminoácido. En la bibliografía ya hay constancia de la estructura molecular básica y las secuencias de aminoácidos de estas proteínas, y las mutaciones correspondientes en el ADN que las codifican.

La espectrometría de masas también se ha usado para cribar poblaciones de trastornos metabólicos heredados (TMH) (Chase y col., Clin. Chem., 49, 1797-1817, 2003).

En seres humanos, las hemoglobinopatías son los trastornos heredados más comunes. Esto resulta de mutaciones a los genes de globina y se han caracterizado más de 800 variantes de hemoglobina (Huisman y col., Human Haemoglobin Variants, 2ª ed., Augusta, GA: Sickle Cell Anemia Foundation 1998), muchas de las cuales son de relevancia no clínica. Las variantes de hemoglobina se detectan normalmente como resultado de programas de cribado preanestésico o de reconocimiento neonatal y prenatal. Las variantes que producen síntomas clínicos también pueden identificarse como parte de investigaciones de diagnóstico. Iniciativas de salud recientes, que han expandido los programas de reconocimiento neonatal y prenatal existentes, han aumentado espectacularmente la carga de trabajo (The NHS Plan July 2000, publicación del parlamento 4818). También han conducido a un requisito para probar sistemas específicos para aquellas variantes de hemoglobina consideradas clínicamente significativas. Los dos programas tienen diferentes objetivos. En el reconocimiento prenatal, el objetivo es identificar vehículos de aquellas hemoglobinopatías que representen un riesgo genético para el feto. Por tanto, el objetivo es detectar la presencia o ausencia de hemoglobina drepanocítica y rasgo de talasemia beta o una de las variantes de hemoglobina que interactúan con ellas, por ejemplo, Hb C, Hb DPunjab, Hb OArab, Hb Lepore y Hb E. Además, están incluidas las otras tres condiciones de importancia potencialmente clínica, concretamente talasemia delta-beta, persistencia hereditaria de rasgo de hemoglobina fetal (HPFH) y rasgo de talasemia alfa-cero también. En el reconocimiento neonatal el objetivo es la identificación temprana de individuos con drepanocitosis y talasemia beta mayor con el fin de iniciar el tratamiento.

El diagnóstico bioquímico clásico de hemoglobinopatías usa información fenotípica generada tanto por técnicas electroforéticas como por cromatografía de intercambio de catiónico (Working Party of General Haematology Task Force, 1998). Esto forma la base de las actuales técnicas de cribado; sin embargo, son lentas, laboriosas y no son específicas. Además, no eligen diana y, por tanto, detectarán variantes de hemoglobina que no son requeridas por los programas de cribado. La espectrometría de masas (EM) de cuadrupolo por electropulverización es posiblemente más rápida, más específica y es más rentable para el cribado de poblaciones.

La mayoría de los procedimientos publicados para la caracterización de hemoglobinopatías usando EM han usado barridos de sangre completa para evaluar las masas de las cadenas de globina intactas seguido de digestión tríptica y análisis de los péptidos (Wild y col., Blood Cells, Molecules and Diseases, 27, 691-704, 2001). De esta forma es posible caracterizar inequívocamente la mayoría de las mutaciones de globina.

Se hace referencia a Wild y col., 2001, (citado anteriormente), para detalles del procedimiento de EM, en particular la sección de procedimientos en la página 693 y la Figura 2, página 697, que muestra espectros de masas de ESI desconvolucionados para la cadena de hemoglobina β variante normal y una particular. La Tabla 1 en la página 698 de Wild y col., 2001, (citado anteriormente), enumera muchos cambios de masas y aminoácidos producidos por cambios de una única base en el triplete que codifica el nucleótido y que son determinables por el procedimiento de EM.

**(Ver fórmula)**

En la solicitud de patente internacional WO 2004/090552 se usa un procedimiento de EM simplificado para detectar la presencia de una mutación de proteínas de drepanocitos de la cadena de globina β. Trabajando desde el conocimiento del polipéptido (natural) normal y su mutante, la EM se basa en especies cargadas y se evita el registro y el análisis de todos los otros datos. Por tanto, es posible detectar una única especie ionizada elegida como diana y para un pico correspondiente a la variante si está presente en la muestra probada. El procedimiento se denomina en lo sucesivo uno de especie ionizada seleccionada específica para la elección como diana. Los procedimientos relacionados también se describen por Shushan y col., Clinical Chemistry, 44, A150, 1998; Liu Tao y col., Shengwu Huaxue Yu Shengwu Wuli Xuebao, 34, 423-432, 2002; Kobold y col., Clinical Chemistry, 43, 1944-1951, 1997; Wan y col., J. Chromatog., 913, 437-446, 2001; y Van Dorsselaer y col., Biochemistry, 28, 2949-2956, 1989.

Nakanishi y col., J. Mass Spectrometry, 30, 1663-1670, 1995, también describe un procedimiento para la identificación de variantes de hemoglobina, pero no desvelan ionizar una serie definida de péptidos de la digestión de proteínas y seleccionar por espectrometría de masas una especie ionizada de relación masa/carga conocida indicativa de una variante de proteína; y someter la especie ionizada seleccionada a disociación inducida por colisión y medir una o más de las especies ionizadas derivadas de relación masa/carga conocida que confirman la presencia de la variante de proteína en una muestra.

Todavía hay varios problemas con los procedimientos de la técnica anterior que incluyen que la especie ionizada elegida como diana que se detecta pueda confundirse con una especie que tiene la relación masa/carga idéntica, y un falta de sensibilidad. Además, cuando una variante de proteína se diferencia de una forma mínima de la proteína natural, puede ser muy difícil distinguir entre la proteína variante y la natural usando EM.

La presente invención se refiere a un procedimiento más sensible para cribar variaciones de proteínas. El aumento de la sensibilidad es particularmente importante cuando la proteína variante está en una muestra obtenida de un individuo que es heterólogo para la proteína variante.

La presente invención proporciona un procedimiento para detectar una variante de proteína conocida en una muestra que comprende:

(i) digerir la proteína para producir una serie... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para detectar una variante de proteína conocida en una muestra que comprende:

(i) digerir la proteína para producir una serie definida de péptidos;

(ii) ionizar los péptidos y seleccionar por espectrometría de masas una especie ionizada de relación masa/carga conocida indicativa de la variante de proteína; caracterizado por

(iii) someter la especie ionizada seleccionada a disociación inducida por colisión y medir una o más de las especies ionizadas derivadas de relación masa/carga conocida que confirman la presencia de la variante de proteína en la muestra.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la variante de proteína es una variante de hemoglobina.

3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que la variante de hemoglobina es S, C, E, DPunjab o OArab .

4. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que la variante de proteína es la cadena delta de hemoglobina.

5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que se seleccionan 1 a 20 especies ionizadas de relación masa/carga conocida.

6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que se seleccionan 1 a 5 especies ionizadas de relación masa/carga conocida.

7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que se selecciona una única especie ionizada que tiene una relación masa/carga conocida.

8. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que la muestra es sangre, orina, líquido cefalorraquídeo o una muestra de tejido.

9. El procedimiento de la presente invención, en el que la proteína se digiere usando una proteasa específica de secuencia.

10. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que la proteasa es tripsina.

11. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que se usa espectrometría de masas de cuadrupolo de ionización por electropulverización para ionizar los péptidos y para seleccionar las especies ionizadas.

12. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que se usa espectrometría de masas de cuadrupolo de ionización por electropulverización para someter las especies ionizadas seleccionadas a disociación inducida por colisión y para medir la una o más especies ionizadas derivadas.

13. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la especie ionizada seleccionada se somete a un nivel de disociación que o bien no produce disociación sustancial de las especies ionizadas seleccionadas o conduce a la producción de una pluralidad de fragmentos ionizados de péptidos.

14. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que el procedimiento comprende adicionalmente someter las especies ionizadas seleccionadas a un nivel de disociación que conduce a la eliminación de aminoácidos de ambos extremos de las especies ionizadas, y detectar los aminoácidos.