MÉTODO PARA LA DETERMINACIÓN DE FACTORES DE RIESGO CARDIOVASCULARES EN SANGRE DESECADA.

Método para la determinación de factores de riesgo cardiovascular en muestras biológicas que comprende las etapas de a) alterar la muestra a una muestra de sangre seca,

b) realizar una preparación de muestra donde sea apropiado, y c) analizar la muestra caracterizado porque los factores de riesgo cardiovascular a determinar es ADMA y/o SDMA y/o una combinación de ADMA y/o SDMA con al menos una sustancia del grupo que consiste en MMA, ARG, lisinas metiladas, isoprostanos, derivados y/o metabolitos de isoprostanos, enzimas, vitaminas, proteína C-reactiva, oxLDL, péptido natriurético tipo B, NT-pro-BNP, homocisteína o troponina T, en el que la etapa a) comprende una hemólisis completa de la muestra biológica

La presente invención está en el campo de los métodos para la determinación de factores de riesgo cardiovascular y factores protectores en muestras biológicas.

Los factores de riesgo cardiovascular incluyen L-arginina (ARG), argininas y lisinas metiladas, isoprostanos, derivados y metabolitos de isoprostanos, enzimas como matrixmetaloproteinasas (MMPs), o vitaminas. Sin embargo, 5 debe entenderse que este listado es a título de ejemplo y de ninguna forma completo.

Entre los factores de riesgo cardiovascular, las argininas metiladas y los inhibidores endógenos dimetilarginina asimétrica (ADMA) y monometil arginina (MMA) son especialmente importantes. Su importancia se basa en el hecho de que son esenciales para la regulación de la síntesis del óxido nítrico (NO) en el cuerpo humano. A su vez, NO es esencial en diversos escenarios fisiológicos, por ejemplo homeostasis del sistema cardiovascular. El desequilibrio 10 del suministro y necesidad de NO es visto como el paso inicial para cambios patofisiológicos que eventualmente conducen a dolencias cardiovasculares como ateroesclerosis, hipertensión, y problemas tromboembólicos. La evidencia acumulada sugiere que tal desequilibrio de NO de homeostasis está principalmente ligado a ADMA. ADMA y MMA se originan de la metilación de arginina de una proteína, se liberan de las proteínas durante la degradación de la proteína. Hasta ahora, se ha visto que el ADMA circulante se altera en pacientes que sufren enfermedades 15 cardiovasculares. Se encuentran elevadas concentraciones de ADMA en plasma en varios escenarios clínicos que van desde fallos renales a ateroesclerosis, diabetes por hipertensión, preeclampsia, enfermedad de alzheimer o incluso depresión o esquizofrenia. Además, en pacientes con enfermedad cardiovascular elevadas concentraciones de ADMA en plasma predicen independientemente la progresión de ateroesclerosis y la mortalidad.

Todas las técnicas analíticas actualmente aplicadas para la determinación de factores de riesgo cardiovascular 20 descansan en la detección de estos factores en muestras de plasma, suero y orina. En muestras de sangre y orina humanas, se han evaluado los parámetros ARG, ADMA, SDMA y MMA conjuntamente con los parámetros bioquímicos tales como la proteína C-reactiva (CRP), isoprostanos, MMPs, Mieloperoxidasa, HDL, LDL o colesterol total para valorar el riesgo cardiovascular (Sydow: Z Kardiol 2001, Böger: Cardiovasc Res 2003, Ridker: Am J Cardiol 2003, Schwedhelm: Clin Chem Lab Med 2003). Sin embargo, el uso de sangre humana requiere separación 25 rápida de los constituyentes de la sangre celular para obtener suero o plasma y por ello evitar la degradación de la muestra. Así, se requieren etapas de preparación de muestra que necesitan equipo adicional en el lugar de la obtención de la muestra, tal como centrifugadoras, pipetas, refrigeradores, etc. La necesidad de preparación de muestra hace que la toma de muestra sea compleja y requiera largo tiempo.

Los métodos más eficaces y preciso hoy utilizados para cuantificar la ARG y sus análogos metilados se basan en 30 LC-MS o LC-MS/MS, aunque se han desarrollado otros varios métodos para determinar estos importantes factores de riesgo cardiovascular: espectrofotometría, electroforesis capilar, cromatografía líquida, GC-MS o ensayos inmunológicos como ELISA. El equipo para LC-MS o LC-MS/MS está disponible solamente en pocos grandes laboratorios. En consecuencia, las muestras de sangre humana tienen normalmente que ser enviadas desde la oficinas de los médicos o farmacias al laboratorio lo que da lugar a que las muestras sean enviadas en estado 35 congelado lo cual hace la etapa de preparación de muestra crucial para la calidad del análisis.

Debido a la importancia de ARG y sus análogos metilados como factores de riesgo cardiovascular, existe una necesidad de un método robusto de preparación de muestras que evite la degradación de los analitos antes de la cuantificación en el laboratorio clínico químico y que permita que un gran número de muestras sea obtenido de forma rutinaria. 40

Es en consecuencia objeto de la invención superar las limitaciones del estado de la técnica y desarrollarun simple pero eficaz método para la determinación de factores de riesgo cardiovascular en muestras biológicas.

Es un objeto adicional de la invención ofrecer medios apropiados para llevar a cabo el el método simple pero eficaz.

El primer objeto de la invención se resuelve por el hecho de que el método comprende las etapas de a) toma de muestra, b) alterar la muestra a una muestra de sangre seca, c)llevar a cabo una preparación de muestra donde sea 45 apropiado y d) analizar la muestra. Alterar la muestra a una muestra de sangre seca resuelve especialmente el primer objeto de la invención. Las muestras de sangre seca en sí mismas se conocen desde que R. Guthrie usó filtros para recoger y secar sangre humana de recién nacidos para análisis subsiguientes de fenilalanina para la detección de fenilcetonuria (PKU). Desde entonces, el uso de muestra de sangre seca se ha extendido desde la inspección de recién nacidos a la investigación virológica y epidemiológica. Se ha usado la sangre seca para la 50 detección de trastornos del metabolismo de aminoácidos, metabolismo de ácidos grasos y ácidos orgánicos, para controlar la infección y la eficacia del tratamiento antibiótico (CRP en puntos de sangre seca de pacientes con fibrosis quística, Cordón SM: J Immunol Methods 1991), homocistinuria (homocisteína en puntos de sangre seca de recién nacidos: Febriani AD: Pediatr Int 2004) y PKU (aminoácidos/acilcarnitinas en puntos de sangre seca de recién nacidos; Chace DH: Clin Chem 2003). 55

Esto principalmente en cuanto a la naturaleza de los analitos investigados y los problemas científicos subyacentes. Respecto a la inspección de recién nacidos o a trastornos del metabolismo de aminoácidos, es más importante obtener la información cualitativa sobre la concentración absoluta lo que requiere conocimientos y técnicas complejas. Además, los analitos en las determinaciones del estado dela técnica muestran una concentración

bastante alta en comparación con factores de riesgo cardiovascular como ADMA. Por ejemplo, las concentraciones de ADMA son normalmente de unos 0,5 mol/l mientras que se encuentra que la fenilalanina está en 30-100 mol/L en niños sanos en comparación a 1,2 mmol/L en pacientes con fenilcetonuria. Eso significa que dicha inspección tal como se usa por el estado de la técnica empleando sangre seca requiere diferenciación de incrementos de 10 a 60 veces en el analito. En contraste, los factores de riesgo cardiovascular tales como ADMA pueden aumentarse en un 5 factor tan pequeño como 1,3-1,5 y aún indicar un riesgo elevado, haciendo necesarios complicados ajustes del estado de la técnica tales como los descritos en la presente invención para compensar por esto.

Una persona experta en la técnica no habría tenido en cuenta el uso de sangre seca para la determinación de factores de riesgo cardiovascular, especialmente ADMA. La razón para esto es que durante el proceso de desecación de la muestra de sangre, la concentración de ADMA en el plasma cambia debido a una lisis parcial de 10 las células de sangre que conduce a una liberación de ADMA anteriormente contenida en las células. Dado que la concentración de diversos analitos en plasma o suero es diferente a la de los mismos en células sanguíneas, tal lisis llevaría a valores erróneos o variables de las concentraciones de ADMA en plasma o suero, Por ello, el experto en la técnica habría confiado en las muestras de plasma o suero para la determinación de la concentración de ADMA. Además, una mancha de sangre desecada es en general un espécimen altamente impreciso comparado con 15 líquidos tales como sangre, plasma u orina. Esto se debe al hecho de que la cantidad de sangre en la mancha de sangre es una función del hematocrito, diámetro de la mancha de sangre, grado de saturación y grado de hemólisis.

Normalmente, una mancha de sangre antes de la desecación tiene un volumen se solamente 20 a 40 l. Usar muestra de sangre seca haría complicada la medición de los factores de riesgo cardiovascular.

Particularmente, si la etapa b) del método inventivo comprende la hemólisis de la muestra completa de sangre y/o 20 una inhibición de enzimas y/o una inhibición de actividad proteolítica y/o un impedimento para oxidación, la desventaja de valores erróneos o variables de las concentraciones en plasma/suero de los analitos es evitada ventajosamente. Permitir... [Seguir leyendo]

1. Método para la determinación de factores de riesgo cardiovascular en muestras biológicas que comprende las etapas de

a) alterar la muestra a una muestra de sangre seca,

b) realizar una preparación de muestra donde sea apropiado, y

c) analizar la muestra 5

caracterizado porque los factores de riesgo cardiovascular a determinar es ADMA y/o SDMA y/o una combinación de ADMA y/o SDMA con al menos una sustancia del grupo que consiste en MMA, ARG, lisinas metiladas, isoprostanos, derivados y/o metabolitos de isoprostanos, enzimas, vitaminas, proteína C-reactiva, oxLDL, péptido natriurético tipo B, NT-pro-BNP, homocisteína o troponina T, en el que la etapa a) comprende una hemólisis completa de la muestra biológica. 10

2. Método de acuerdo a la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa c) se realiza por uso de al menos una de las siguientes técnicas de medición: espectrometría de masas, preferiblemente espectrometría tandem de masas, inmunoensayo, preferiblemente enzimático o radioinmunoensayo, ensayo basado en fluorescencia, ensayo basado en quimioluminiscencia.

3. Método de acuerdo a la reivindicación 1, caracterizado porque la muestra biológica es una muestra de 15 sangre completa.

4. Método de acuerdo a una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la etapa a) comprende la muestra de sangre completa y/o una inhibición de enzimas y/o una inhibición de actividad proteolítica y/o un impedimento para oxidación.

5. Uso de un filtro de sangre seca para poner en práctica un método de acuerdo a la reivindicación 1, 20 caracterizado porque el filtro de sangre seca comprende al menos una sustancia del grupo que consiste en antioxidantes, coagulantes, desinfectantes, detergentes e inhibidores.

6. Uso de un filtro de sangre seca de acuerdo a la reivindicación 1, caracterizado porque comprende poros con tamaños desiguales de poro para separar células sanguíneas del plasma.