Polipéptido GH-61 comprendiendo una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80% de identidad con los aminoácidos del polipéptido maduro de la SEC ID NO:2

Polipéptidos de la familia GH-61.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al uso de un polipéptido de la familia GH-61 para preparar un producto comestible. La invención también se refiere a polipéptidos GH-61 de polipéptidos que mejoran las propiedades del producto comestible. La invención además se refiere a polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos, a constructos de ácidos nucleicos que comprenden tales polinucleótidos y a vectores de expresión y células huéspedes recombinantes que comprenden tales constructos. La invención también se refiere a procesos para la preparación de dichos polipéptidos y a composiciones que comprenden dichos polipéptidos.

Antecedentes de la invención

Los carbohidratos y conjugados de glicol son sustratos para glicosil transferasas (GTs) y glicósido hidrolasas (GHs). La estructura de las glicósido hidrolasas empezó a ser descifrada a partir de la década de 1980. Al mismo tiempo, se descubrieron nuevas proteínas de GH y se determinó su secuencia de aminoácidos. Dos observaciones principales surgieron de los nuevos datos. 1) el sistema tradicional de nomenclatura E.C. para nombrar familias de enzimas no era lo suficientemente preciso para clasificar el número creciente de enzimas que tenían una estructura diferente, pero que realizaban la misma reacción enzimática. 2) las enzimas relacionadas por homología podían tener una actividad enzimática diferente, por lo que también el sistema de nomenclatura E.C. resultaba confuso para estas enzimas relacionadas. Bernard Henrissat propuso en 1991 un nuevo sistema de nomenclatura basado en las familias y en la estructura de las enzimas (Henrissat B., A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities. Biochem. J. 280:309-316(1991); Henrissat B., Bairoch A. New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities. Biochem. J. 293:781-788(1993); Henrissat B., Bairoch A. Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases. Biochem. J. 316:695-696(1996) y Davies g., Henrissat B. Structures and mechanisms of glycosyl hydrolases. Structure 3:853-859(1995).). La clasificación en familias de las glicósido hidrolasas según la similitud de la secuencia de aminoácidos se introdujo porque existe una relación directa entre la secuencia y las similitudes de pliegue, y se espera que tal clasificación:

(i) refleje las características estructurales de las enzimas, que no pueden reflejarse sólo mediante la especificidad de sustrato,

(ii) ayude a revelar las relaciones evolutivas entre las enzimas, y

(iii) proporcione una herramienta conveniente para obtener información mecanicista.

Las secuencias de aminoácidos agrupadas según la naturaleza de su similitud con una familia de GH en particular pueden dar una idea en cuanto a la actividad de la hipotética nueva proteína. Posteriormente se ha sugerido que algunas de estas secuencias de aminoácidos, agrupadas en familias de GH por homología tienen cierta actividad enzimática. Así, en resumen, el agrupamiento de una nueva secuencia de aminoácidos en una familia de GH no indica específicamente la actividad enzimática exacta. La actividad enzimática debe ser demostrada mediante un ensayo de actividad de la proteína purificada o clonada. Si el ensayo es difícil, la determinación de la función real de las proteínas puede permanecer sin revelar durante años.

La información disponible públicamente de la familia GH-61 cuenta actualmente con sólo 6 secuencias de nucleótidos de función desconocida. No obstante, un documento divulga una conjetura sobre una de estas secuencias (secuencia SwissProt 014405) que codifica una enzima de endoglucanasa (Saloheimo m., Nakari-Setaelae T., Tenkanen m., Penttilae M.; (1997) "cDNA cloning of a Trichoderma reesei cellulase and demonstration of endoglucanase activity by expression in yeast".; Eur. J. Biochem. 249: 584-591(1997). Un trabajo realizado por el mismo grupo confirmó que la enzima GH61A, una vez purificada, mostraba una actividad de celulasa muy débil. El propio grupo admitió que, ya que la actividad era tres veces de magnitud inferior a las celulasas normales, quizás la celulasa no era el sustrato nativo correcto para la enzima. El grupo también hizo un estudio exhaustivo de la enzima purificada con todos los ensayos de otros carbohidratos conocidos (mananasa, galactanasa etc.) y descubrieron que la enzima no tenía actividad para estos sustratos. Los autores concluyen en su discusión que: "En consecuencia, es poco probable que el hongo produzca Cel61A para su actividad endoglucanasa cuando ya está produciendo endoglucanasas más eficientes... Puede ser que tanto TrCel61A como AbCel61A sean activas contra partes específicas de un sustrato celulósico natural más complejo. Sin embargo, se debe realizar más estudios para descubrir la función de las enzimas glicósido hidrolasas 61" (página 6505).

Actualmente, el sitio web de CAZY (http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/) revela una lista de la familia GH-61 no clasificada, lo que significa que propiedades como el mecanismo, nucleófilo catalítico/base, dadores catalíticos de protones, y estructura 3-D no se conocen para las enzimas que pertenecen a esta familia. Aquí la única actividad conocida listada es la actividad de endoglucanasa.

A pesar del examen exhaustivo los bancos de levaduras recombinantes de Trichoderma reesei para celulasas y de la recuperación de muchas otras celulasas de otras familias de GH, no hemos identificado específicamente ninguna endoglucanasa de la familia de GH-61 de Trichoderma reesei que indique así también que GH61, si dicha familia no incluye celulasas, tiene sólo una actividad muy débil y por tanto no se puede detectar mediante un examen de actividad celulasa recombinante, generalmente muy sensible. Por lo que, las 6 secuencias actuales de nucleótidos descritas públicamente y que pertenecen a la familia GH-61 son o marcos de lectura abiertos desconocidos que comparten homología con la secuencia SwissProt 014405 o secuencias clonadas basadas en la purificación y secuenciación de un gen inducido de celulosa (Isolation and characterization of a cellulose-growth-specific gene from Agaricus bisporus, Gene 119:183-190(1992), y además de la proteína Cel61A mencionada anteriormente, la técnica no tiene conocimiento alguno de la función y propiedades de ninguna proteína o péptido que pertenezca a la familia GH-61 ni tampoco se ha descubierto de manera fiable ninguna enzima y/o demostrado su función.

Resumen de la invención

Debido a nuestros esfuerzos en la búsqueda de nuevas carbohidrasas, hemos descubierto ahora por primera vez polipéptidos de la familia GH-61 que proporcionan propiedades mejoradas en productos comestibles, particularmente con un efecto antideterioro en productos comestibles donde el polipéptido maduro comprende SEC ID No.2.

Por lo tanto, en un primer aspecto, la invención provee un uso del polipéptido GH-61 antideterioro de la invención para preparar un producto comestible.

En otro aspecto, la invención provee un polipéptido GH-61 aislado con un efecto antideterioro en productos comestibles.

En otros aspectos, la invención provee un polinucleótido que codifica el polipéptido de la invención; un constructo de ácidos nucleicos comprendiendo el polinucleótido que codifica el polipéptido, vinculado operativamente a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido hacia un huésped adecuado; un vector de expresión recombinante comprendiendo el constructo de ácidos nucleicos de la invención y una célula huésped recombinante comprendiendo el constructo de ácidos nucleicos de la invención.

En otro aspecto más, la invención provee una composición comprendiendo el polipéptido GH-61 de la invención.

En otros aspectos más, la invención provee métodos para producir un polipéptido GH-61 según la invención que incluye un método que comprende:

(a) el cultivo de una cepa, la cual, en su forma salvaje es capaz de producir el polipéptido, para producir el polipéptido; y

(b) la recuperación del polipéptido

y un método que comprende:

(a) el cultivo de una célula huésped recombinante según la invención en condiciones apropiadas para la producción del polipéptido y

(b) la recuperación del polipéptido.

En... [Seguir leyendo]

1. Polipéptido GH-61 comprendiendo una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80% de identidad con los aminoácidos del polipéptido maduro de la SEC ID NO:2.

2. Polipéptido según la reivindicación 1 que consiste en los aminoácidos de los polipéptidos maduros de SEC ID NO:2.

3. Polipéptido según la reivindicación 1 comprendiendo al menos una sustitución, deleción o inserción al exterior de las partes conservadas de la secuencia de aminoácidos.

4. Polipéptido según la reivindicación 1 comprendiendo al menos una sustitución al interior de las partes conservadas.

5. Polipéptido según la reivindicación 3, donde el número de sustituciones, deleciones o inserciones es al máximo de 10.

6. Polipéptido según la reivindicación 1 codificado por un polinucleótido comprendiendo la secuencia de nucleótidos de los nucleótidos 52 a 699 de la SEC ID NO:1, o secuencias que difieren de 52 a 699 de la SEC ID NO:1, en virtud de la degeneración del código genético.

7. Polipéptido según la reivindicación 6 codificado por un polinucleótido que consiste en una secuencia de nucleótidos de los nucleótidos 52 a 699 de la SEC ID NO:1, o secuencias que difieren de 52 a 699 de la SEC ID NO:1 en virtud de la degeneración del código genético.

8. Polinuleótido comprendiendo una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. Polinucleótido según la reivindicación 8 comprendiendo una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:2 o los polipéptidos maduros de la misma.

10. Polinucleótido según la reivindicación 9 que consiste en la región de SEC ID NO:1, que codifica el polipéptido maduro.

11. Polinucleótido según la reivindicación 8 comprendiendo una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 80% de identidad con los nucleótidos 52 a 699 de SEC ID NO:1.

12. Constructo de ácidos nucleicos comprendiendo una secuencia de nucleótidos según las reivindicaciones 8 a 11 vinculada a una o más secuencias de control que dirigen la expresión de la secuencia codificante en una célula huésped adecuada en condiciones compatibles con las secuencias de control.

13. Vector de expresión recombinante comprendiendo el constructo de ácidos nucleicos definido en la reivindicación 12.

14. Célula huésped recombinante comprendiendo el constructo de ácidos nucléicos según la reivindicación 12.

15. Método para la producción de un polipéptido según las reivindicaciones 1 a 7 comprendiendo:

(a) el cultivo de una célula huésped recombinante tal como se define en la reivindicación 14 en condiciones adecuadas para la producción del polipéptido; y

(b) la recuperación del polipéptido.