POLIPÉPTIDOS DE CAMPYLOBACTER JEJUNI UBICADOS EN SUPERFICIE.

Composición que comprende - un polipéptido que comprende la secuencia SEQ ID NO:

43 en donde X1 es V o A y X2 es A o T y X3 es T o A, o comprende un fragmento antigénico seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 74-81 o una variante de dicha secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos el 75% con dicha secuencia, - un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica para dicho polipéptido, - un vector de expresión que comprende una secuencia que codifica para dicho polipéptido, - un virus recombinante o una célula recombinante que comprende dicho polinucleótido o dicho vector de expresión, o - un anticuerpo que puede unirse a dicho polipéptido, para su uso como medicamento

Campo de la invención

La presente invención se refiere a polipéptidos ubicados en la superficie celular de Campylobacter jejuni y su uso en la inmunización frente a la infección por Campylobacter, en el diagnóstico de Campylobacter y en la identificación de compuestos con actividad anti-Campylobacter.

Antecedentes de la invención

Incidencia de infecciones por Campylobacter

Campylobacter, una bacteria microaerófila gram-negativa, se identificó por primera vez como un patógeno humano en 1973. Desde entonces se ha convertido en la causa bacteriana más común de enfermedad diarreica en el mundo desarrollado, produciendo más enfermedad que los patógenos transmitidos por alimentos más reconocidos tradicionalmente, las especies de Shigella (spp). y Salmonella spp. combinadas. De las diferentes cepas de Campylobacter que producen enfermedad, C. jejuni es la más importante, siendo responsable del 99% de casos de campilobacteriosis. A nivel global, la vigilancia ha indicado una elevación constante en el número de casos notificados de campilobacteriosis desde que este organismo se reconoció por primera vez como patógeno. En efecto, la Organización Mundial de la Salud reconoce en la actualidad que las bacterias que producen campilobacteriosis son los agentes más importantes de enteritis en el mundo. Los funcionarios de salud pública internacionales estiman que C. jejuni solo produce de 400 a 500 millones de casos de diarrea en todo el mundo cada año, y es el patógeno transmitido por alimentos número uno en los Estados Unidos. Datos recientes durante el año 2000 ilustran la importancia de Campylobacter con respecto a otras causas más divulgadas de enfermedades transmitidas por alimentos. Campylobacter es responsable más casos, hospitalizaciones y muertes que las enfermedades transmitidas por alimentos mediadas por Salmonella o E. coli. Entre el conjunto de datos, Campylobacter representa más del 55% de los casos y el 33% de hospitalizaciones.

Síntomas de las infecciones por Campylobacter

La diarrea es la manifestación más constante y destacada de la campilobacteriosis. A menudo es con sangre. Los síntomas típicos de la infección por C. jejuni también incluyen fiebre, nausea, vómitos, dolor abdominal, cefalea y dolor muscular. La mayoría de los casos son leves y no requieren hospitalización y pueden resolverse espontáneamente. Sin embargo, la infección por C. jejuni puede ser grave y potencialmente mortal. La muerte es lo más común cuando están presentes otras enfermedades (por ejemplo cáncer, enfermedad hepática y enfermedades relacionadas con la inmunodeficiencia). Los niños menores de cinco años de edad y los adultos jóvenes de 15-29 años de edad son los grupos de edad afectados más frecuentemente. El periodo de incubación (el tiempo entre la exposición y el inicio del primer síntoma) es normalmente de dos a cinco días, pero el inicio puede producirse en tan sólo 2 días o hasta 10 días tras la ingestión. La enfermedad habitualmente no dura más de una semana, sin embargo, los casos graves pueden persistir hasta durante tres semanas (CDC Guidelines for confirmation of foodborne disease outbreaks. MMWR, 1996; 45:59).

Consecuencias a largo plazo de Campylobacter

La infección por Campylobacter a veces puede tener consecuencias a largo plazo. Algunos pacientes pueden desarrollar una enfermedad, denominada síndrome de Guillain-Barré, que afecta a los nervios del cuerpo tras la campilobacteriosis. Aunque es poco frecuente, es la causa más común de parálisis generalizada aguda en el mundo occidental. Comienza varias semanas tras la enfermedad diarreica en una pequeña minoría de pacientes con Campylobacter. Se produce cuando el sistema inmunitario de una persona genera anticuerpos contra componentes del Campylobacter y estos anticuerpos atacan los componentes de las células nerviosas del cuerpo porque son químicamente similares a componentes bacterianos.1 El síndrome de Guillain-Barré comienza en los pies y se extiende por el cuerpo. Las sensaciones de pinchazos dan paso a debilidad que puede conducir a parálisis. Dura de semanas a meses y a menudo requiere cuidado intensivo. La recuperación completa es común, sin embargo los pacientes pueden quedar con daño neurológico grave. Aproximadamente el 15% de los pacientes con Guillain-Barré permanecen postrados en cama o confinados a una silla de ruedas tras un año. Se estima que aproximadamente uno de cada 1000 (0,1 %) casos de campilobacteriosis notificados conduce al síndrome de Guillain-Barré. Hasta el 40% de los casos del síndrome de Guillain-Barré en el RU se producen tras campilobacteriosis2.

El síndrome de Miller-Fisher es otro síndrome neurológico relacionado que puede seguir a la campilobacteriosis y se produce también por imitación inmunológica 1. En el síndrome de Miller-Fisher, los nervios de la cabeza se ven más afectados que los nervios del cuerpo.

Otra afección crónica que puede asociarse con la infección por Campylobacter es una artritis denominada síndrome de Reiter. Ésta es una artritis reactiva que afecta lo más comúnmente a grandes articulaciones que soportan peso tales como las rodillas y la parte inferior de la espalda. Es una complicación que se asocia fuertemente con una

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composición genética particular; son más susceptibles las personas que tienen el antígeno linfocitario humano B27 (HLA-B27).

Además, el Campylobacter puede producir también apendicitis o infectar la cavidad abdominal (peritonitis), el corazón (carditis), el sistema nervioso central (meningitis), la vesícula biliar (colecistitis), las vías urinarias y el torrente sanguíneo.

Bibliografía:

1. Ang CW et al. (2001) Infect Immun. 69(4):2462-2469.

2. Rees et al. (1995) N Engl J Med 333:1374-1379.

Tratamiento de la campilobacteriosis

Los pacientes con campilobacteriosis deben beber mucho líquido mientras que dure la diarrea con el fin de mantener la hidratación. Las medicaciones antidiarreicas tales como loperamida pueden disipar algunos síntomas. Campylobacter es habitualmente una enfermedad que se resuelve espontáneamente, pero cuando se identifica, está indicado el tratamiento específico con antibióticos, ya que el tratamiento puede acortar el transcurso de la enfermedad. En casos más graves de gastroenteritis, se inicia habitualmente un tratamiento con antibióticos antes de que se conozcan los resultados de los cultivos. Los antibióticos macrólidos (eritromicina, claritromicina o azitromicina) son los agentes más eficaces para C. jejuni. También pueden usarse antibióticos de fluoroquinolonas (ciprofloxacino, levofloxacino, gatifloxacino o moxifloxacino).

Sin embargo, se ha notificado la resistencia de Campylobacter a agentes antimicrobianos en muchos países y está en aumento (Pedungton y Kaneene (2003) J. Vet. Med. Sci. 65(2):161-170). La resistencia a quinolonas está en aumento en Europa, Asia y los Estados Unidos. El aumento de la resistencia está relacionado, al menos parcialmente, con el uso de los antibióticos en los piensos para aves (Smith et al. (1999) N Engl J Med 340:15251532).

Estrategias novedosas para el tratamiento, la prevención y el diagnóstico de Campylobacter

Debido a que el aumento en la incidencia y la aparición extendida de resistencia, existe una necesidad considerable del desarrollo de nuevos productos eficaces para el tratamiento y la prevención de infecciones por Campylobacter. Por un lado, debido a la aparición de resistencia, existe una necesidad de compuestos anti-Campylobacter novedosos. Por otra parte, estudios observacionales y experimentales han proporcionado evidencias de desarrollo de inmunidad adquirida en seres humanos, lo que conduce a soportar el concepto del desarrollo de vacunas, en particular para los grupos de riesgo (Scott y Tribble (2000) En: Campylobacter, 2ª ed. Ed. de Nachamkin y Blaser, American Society for Microbiology, págs. 303-319). Además, existe una necesidad de nuevos métodos rápidos y fiables para el diagnóstico de las infecciones por Campylobacter.

Estos objetivos pueden lograrse mediante la identificación y el uso de polipéptidos adecuados de Campylobacter jejuni que pueden funcionar como dianas, es decir dianas para el sistema inmunitario y/o para anticuerpos, dianas para inhibidores citotóxicos, o dianas para restos indicadores en diagnóstico.

El documento WO 02/077183 (Elitra) se refiere a secuencias de ácidos nucleicos antisentido que... [Seguir leyendo]

1. Composición que comprende -un polipéptido que comprende la secuencia SEQ ID NO:43 en donde X1 es V o A y X2 es A o T y X3 es T o A, o comprende un fragmento antigénico seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 74-81 o una variante de dicha secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos el 75% con dicha

secuencia, -un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica para dicho polipéptido, -un vector de expresión que comprende una secuencia que codifica para dicho polipéptido, -un virus recombinante o una célula recombinante que comprende dicho polinucleótido o dicho vector de

expresión, o -un anticuerpo que puede unirse a dicho polipéptido, para su uso como medicamento.

2. Composición según la reivindicación 1, en donde la composición comprende

- un polipéptido que comprende la secuencia SEQ ID NO:43 en donde X1 es V o A y X2 es A o T y X3 es T o A, o comprende un fragmento antigénico seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 74-81 o una variante de dicha secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos el 75% con dicha secuencia,

- un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica para dicho polipéptido,

- un vector de expresión que comprende una secuencia que codifica para dicho polipéptido, o

- un virus recombinante o una célula recombinante que comprende dicho polinucleótido o dicho vector de expresión.

3. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho polinucleótido comprende la secuencia SEQ ID NO:120.

4. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la variante tiene una identidad de secuencia de al menos el 95%, tal como al menos el 96%, por ejemplo al menos el 97%, tal como al menos el 98%, por ejemplo al menos el 99% con dicha secuencia.

5. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el polipéptido comprende una etiqueta, por ejemplo una cola de histidinas.

6. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la célula recombinante es una célula de Escherichia coli de virulencia atenuada o reducida o una célula de Salmonella de virulencia atenuada o reducida.

7. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la célula recombinante está viva.

8. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la célula recombinante está muerta.

9. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 2-8, en la que el medicamento es una vacuna.

10. Composición según la reivindicación 9, comprendiendo la composición un portador inmunogénico, por ejemplo una proteína transportadora, en la que el portador inmunogénico preferiblemente está unido a dicho polipéptido.

11. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 9-10, comprendiendo la composición un adyuvante.

12. Composición según la reivindicación 1, comprendiendo la composición un anticuerpo que puede unirse al polipéptido deSEQ IDNO: 43, en dondeX1es Vo AyX2 esA o TyX3 esT oA.

13. Composición según la reivindicación 12, en la que el anticuerpo puede unirse además a una célula de Campylobacter jejuni intacta.

14. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 13, en la que el anticuerpo es policlonal.

15. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 13, en la que el anticuerpo es monoclonal.

16. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, en la que el anticuerpo es un anticuerpo humano o anticuerpo humanizado.

17. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 13, en la que el anticuerpo es un fragmento de unión de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en Fab, Fab', F(ab)2 y Fv.

18. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, comprendiendo la composición un vehículo farmacéuticamente aceptable.

19. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, siendo la composición adecuada para administración sistémica.

20. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, siendo la composición adecuada para administración intravenosa, intramuscular o subcutánea.

21. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, siendo la composición adecuada para administración oral.

22. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, siendo la composición adecuada para administración intranasal.

23. Anticuerpo que puede unirse al polipéptido de SEQ ID NO:43, en donde X1 es V o A y X2 es A o T y X3 es T

o A o un fragmento antigénico seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 74-81 o una variante de dicha secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos el 75% con dicha secuencia, para su uso como medicamento.

24. Anticuerpo según la reivindicación 23, en donde el anticuerpo puede unirse además a una célula de Campylobacter jejuni intacta.

25. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 24, siendo el anticuerpo policlonal.

26. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 24, siendo el anticuerpo monoclonal.

27. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 26, siendo el anticuerpo un anticuerpo humano o anticuerpo humanizado.

28. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 24, siendo el anticuerpo un fragmento de unión de un anticuerpo.

29. Célula de Escherichia coli recombinante de virulencia atenuada o reducida o de Salmonella recombinante de virulencia atenuada o reducida transformada o transfectada con un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica para el polipéptido de SEQ ID NO:43 en donde X1 es V o A y X2 es A o T y X3 es T o A, o que codifica para un fragmento antigénico seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 7481 o una variante de dicha secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos el 75% con dicha secuencia, para su uso como medicamento.

30. Uso de

- un polipéptido que comprende la secuencia SEQ ID NO:43, en la que X1 es V o A y X2 es A o T y X3 es T o A, o comprende un fragmento antigénico seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 74-81 o una variante de dicha secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos el 75% con dicha secuencia

- un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica para dicho polipéptido,

- un vector de expresión que comprende una secuencia que codifica para dicho polipéptido, o

- un virus recombinante o una célula recombinante que comprende dicho polinucleótido o dicho vector de expresión,

para la preparación de un medicamento para la inmunización de un animal o un ser humano frente a infecciones por Campylobacter, preferiblemente Campylobacter jejuni.

31. Uso según la reivindicación 30, en donde la inmunización induce una respuesta inmunitaria protectora.

32. Uso según la reivindicación 30 ó 31, en el que el medicamento es un medicamento adecuado para administración parenteral, intravenosa, intramuscular, subcutánea, oral o intranasal.

33. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 30-32, en el que el medicamento comprende además un adyuvante.

34. Uso de un anticuerpo que puede unirse al polipéptido de SEQ ID NO:43, en donde X1 es V o A y X2 es A o T y X3 es T o A o un fragmento antigénico seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 74-81 o una variante de dicha secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos el 75% con dicha secuencia, preferiblemente un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 28, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de infecciones por Campylobacter, preferiblemente Campylobacter jejuni, en un animal o un ser humano.

35. Método para detectar Campylobacter jejuni en una muestra que comprende las etapas de

a. poner en contacto dicha muestra con un resto indicador que puede unirse específicamente al polipéptido de SEQ ID NO:43, en donde X1 es V o A y X2 es A o T y X3 es T o A, en donde el resto indicador además puede unirse específicamente a células de Campylobacter jejuni intactas, y

b. determinar si se ha generado una señal por el resto indicador, detectando de ese modo si dicha muestra contiene Campylobacter jejuni.

36. Método según la reivindicación 35, en donde dicho resto indicador no pasa a través de la membrana externa de una célula de Campylobacter jejuni.

37. Método según cualquiera de las reivindicaciones 35 a 36, en donde dicho resto indicador consiste en o comprende un anticuerpo, como un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 17.

38. Método para identificar un inhibidor del polipéptido de SEQ ID NO:43, en donde X1 es V o A y X2 es A o T y X3 es T o A, que comprende las etapas de

a. proporcionar dos células que difieren en el nivel del polipéptido de SEQ ID NO:43, en donde X1 es V o A y X2 es A o Ty X3 es To A,

b. determinar la sensibilidad de dichas células a un inhibidor putativo, por ejemplo mediante un ensayo de crecimiento, en donde el inhibidor putativo no puede pasar a través de la membrana externa de una célula de Campylobacter jejuni,y

c. determinar si dichas dos células se ven afectadas de manera diferente por la presencia de dicho inhibidor putativo.

39. Método para identificar una pareja de unión derivada del hospedador del polipéptido de SEQ ID NO:43, en donde X1 es V o A y X2 es A o T y X3 es T o A o un fragmento antigénico seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 74-81, que comprende las etapas de

a. proporcionar membranas del hospedador purificadas y separadas por electroforesis transferidas sobre una membrana,

b. incubar dichas membranas del hospedador con el polipéptido de SEQ ID NO:43 en donde X1 es V o A y X2 es A o T y X3 es T o A o un fragmento antigénico seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 74-81,

c. detectar la unión usando anticuerpos específicos para el polipéptido de SEQ ID NO:43 en donde X1 es V o A y X2 es A o T y X3 es T o A o un fragmento antigénico seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 74-81, e

d. identificar la pareja de unión mediante elución de dicha membrana de ransferencia y posterior análisis.