POLIPÉPTIDO E2 DE PAPILOMAVIRUS UTILIZADO PARA LA VACUNACIÓN.

Polipéptido E2 de papilomavirus utilizado para la vacunación. La presente invención se refiere a un vector que comprende moléculas de ácidos nucleicos codificantes de por lo menos dos polipéptidos E2 de papilomavirus, en el que dichas moléculas de ácidos nucleicos codificantes de dichos E2 no comprenden una parte de 40 o más nucleótidos contiguos que muestran un porcentaje de identidad de 75% o superior a 75% entre dos cualesquiera de dichas moléculas de ácidos nucleicos codificantes de E2. La invención resulta de muy especial interés en el campo de la inmunoterapia, y más particularmente para tratar pacientes que sufren de una infección persistente por papilomavirus. Los papilomavirus han sido aislados en varios organismos superiores, en los que infectan los tejidos epiteliales de la piel y mucosas. En la actualidad, se han identificado en el ser humano más de 100 genotipos del papilomavirus humano (HPV) (Stoler, Int. J. Gynecol. Path. 19:16-28, 2000), que pueden clasificarse en genotipos de "bajo riesgo" habitualmente asociados a tumores benignos (por ejemplo HPV-6 y HPV-11) y genotipos de "alto riesgo", que se asocian a lesiones con potencial de progresar a lesiones premalignas (por ejemplo la neoplasia intraepitelial cervical, CIN) y finalmente a tumores malignos. Por ejemplo, más de 99% de los cánceres cervicales contienen ADN del HPV y se han identificado cinco genotipos de HPV (HR-HPV) de "alto riesgo" como la causa principal, detectando HPV-16 y HPV-18 en aproximadamente 70% de los cánceres cervicales invasivos diagnosticados en todo el mundo (Clifford et al., Br. J. Cancer 88:63-73, 2003), mientras que HPV-31, HPV-33 y HPV-45 explican un 10% adicional (Cohen et al., Science 308:618-621, 2005). Los papilomavirus son virus de ADN de un tamaño reducido circundados por una cápside de proteínas (ver, por ejemplo, Pfister, 1987, en: The papovaviridae: The Papillomaviruses, edición de Salzman y Howley, Plenum Press, New York, páginas 1 a 38). El genoma es un ADN circular de doble cadena de aproximadamente 7.900 pares de bases que consta de tres regiones funcionales, las regiones temprana (E), tardía (L) y larga de control (LCR). La LCR contiene secuencias reguladoras de la transcripción, tales como intensificadores y promotores. La región tardía codifica las proteínas estructurales L1 y L2, respectivamente las proteínas de cápside mayor y menor, mientras que la región temprana codifica proteínas reguladoras (E1-E7), presentes predominantemente en el núcleo, que controlan la replicación vírica, la transcripción y la transformación celular. La proteína E1 es la de mayor tamaño (E1 de HPV-16 presenta una longitud de 649 aminoácidos) y la más conservada codificada por el genoma de papilomavirus. El E1 es una fosfoproteína de unión a ADN con una actividad helicasa dependiente de ATP que requiere la dimerización e interacción con E2 para estimular la replicación vírica (Desaintes y Demeret, Semin. Cancer Biol. 7:339-347, 1996; Wilson et al., Virus Gene 24:275-290, 2002). La actividad helicasa se ha localizado en el dominio C-terminal de E1 y el dominio de unión a ADN, en el dominio central. La proteína E2 (E2 de HPV-16 presenta una longitud de 365 aminoácidos) es una fosfoproteína de unión a ADN multifuncional que regula la transcripción génica vírica y controla la replicación del ADN (Bechtold et al., J. Virol. 77:2021-2028, 2003). La regulación de la transcripción vírica requiere la dimerización y unión de los dímeros de E2 a un sitio de unión a E2 (secuencia de consenso ACCN6GGT), cuyo contexto determina si la transcripción vírica se transactiva o se reprime (Ham et al., Trends Biochem. Sci. 16:440-444, 1991; McBride et al., J. Biol. Chem. 266:18411-18444, 1991). La E2 también proporciona la represión del promotor p97 de HPLV-16, que controla la expresión de las oncoproteínas E6 y E7. Finalmente, la E2 se encuentra implicada en la distribución del genoma vírico en las células hija. El dominio N-terminal de la E2 de HPV-16 es responsable de la transactivación, de la interacción con E1 y de la estimulación de la replicación, mientras que el dominio C-terminal se encuentra implicado en la unión y dimerización del ADN (McBride et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:510-514, 1989). La proteína codificada por E4 se une y altera la red citoplasmática de queratina y desempeña un papel en la maduración vírica. Todavía no se conoce con exactitud cuál es la función de la proteína E5. Las proteínas E6 y E7 se encuentran implicadas en la transformación oncogénicas de las células infectadas por HR-HPV (Kanda et al., J. Virol. 62:610- 613, 1988; Vousden et al., Oncogene Res. 3:1-9, 1988; Bedell et al., J. Virol. 61:3635-3640, 1987) a través de la unión de estas proteínas víricas a los productos génicos celulares de supresión tumoral p53 y retinoblastoma (Rb), respectivamente (revisados en Howley, Papillomaviruses and their replication, páginas 2045 a 2076, en: B.N. Fields, D.M. Knipe y P.M. Howley (editores), Virology, 3a edición, Lippincott-Raven Press, New York, N.Y., 1996). La infección por el HPV es una de las infecciones de transmisión sexual más frecuentes y aproximadamente 25% de los adultos sexualmente activos se encuentran infectados por HPV (Woodman et al., The Lancet 357:1831-1836, 2001). Aproximadamente el 80% de los sujetos consiguen erradicar espontáneamente el virus en 6 a 12 meses (Ho et al., N. Engl. J. Med. 338:423-428, 1998). Sin embargo, en el 20% restante, la infección por HPV progresa a lesiones premalignas CIN que, si no se diagnostican, pueden conducir a cánceres invasivos (O'Shaughnessy et al., Clinical Cancer Research 2:314-346, 2002). El mecanismo inductor de la neoplasia aparentemente implica la integración del genoma del HPV en los cromosomas celulares (Cullen et al., J. Virol. 65:606-612, 1991). En mayoría de casos, lo anterior lleva a la interrupción del ADN genómico del HPV en la región E1/E2, a la liberación del promotor E6/E7 del efecto represor de E2 y en consecuencia a la regulación positiva de la expresión de E6 y E7 y a la transformación celular. En la actualidad, las vacunas profilácticas destinadas a prevenir la infección por HPV están próximas a 2   comercializarse. Presentan como diana proteínas de la cápside expresadas en la superficie vírica, con el fin de bloquear al virus antes de que penetre en las células huésped principalmente mediante la inducción de anticuerpos neutralizadores. Generalmente se basan en proteínas L1 de producción recombinante que se reensamblan espontáneamente formando VLP (partículas similares a virus). Dos vacunas para HPV fabricadas por Merck y GlaxoSmithKline (GSK) han completado con éxito los ensayos clínicos de fase III mostrando una eficacia de prácticamente el 100% en la prevención de infecciones cervicales de tipo específico. La vacuna de GSK comprende una mezcla de VLP de HPV-16 y HPV-18, mientras que Merck también ha incluido VLP de HPV-6 y HPV-11, que causan verrugas genitales. Sin embargo, los sujetos ya infectados por HPV no pueden seleccionares para la vacunación profiláctica y las vacunas terapéuticas resultarían de interés para tratar a los pacientes infectados con riesgo de desarrollar lesiones con potencial oncogénico. Debido a que la actividad oncogénica se ha atribuido a la expresión de los genes E6 y E7 del HPV en las células infectadas, se ha dedicado mucho esfuerzo a bloquear su expresión o a inducir una respuesta inmunológica celular contra dichos productos génicos transformantes. Se han descrito numerosos enfoques en la literatura, por ejemplo basados en la utilización de ARN antisentido (Steele et al., Cancer Res. 53:2330-2337, 1993; He et al., Cancer Res. 57:3993-3999, 1997; Choo et al., Gynecol. Oncol. 78:293-301, 2000), ribozimas (Chen et al., Cancer Gen. Ther. 3:18-23, 1996; Pan et al., Mol. Ther. 9:596-606, 2004), ARNip (Butz et al., Oncogene 22:5938-5945, 2003; Koivusalo et al., Mol. Pharmacol. 68:372-382, 2005), péptidos inmunogénicos (Feltkamp et al., Eur. J. Immunol. 23:2242-2249, 1993), plásmidos codificantes de E6 y/o E7 (Peng et al., J. Virol. 78:8468-8476, 2004) y vectores víricos (documentos WO 90/10459 y 99/03885; Kaufmann et al., Clinical Cancer Res. 8:3676-3685, 2002). Debido a que se expresa en un estadio temprano de la infección por HPV, la proteína E2 representa una segunda diana potencial para la vacunación terapéutica. Los estudios preclínicos realizados en conejos infectados por papilomavirus de la cola de algodón del conejo (CRPV) han demostrado protección frente a lesiones implementadas asociadas a papilomavirus tras la expresión de E2. Por ejemplo, la administración de un vector adenovirus recombinante que expresa la proteína E2 de CRPV resultó en la eliminación del papiloma inducido por CRPV y la infección, probablemente a través de inmunidad mediada por células... [Seguir leyendo]

1. Vector que comprende moléculas de ácidos nucleicos codificantes de por lo menos dos polipéptidos E2 de papilomavirus, en el que dichas moléculas de ácidos nucleicos codificantes de E2 no comprenden una porción de 40 o más nucleótidos contiguos que muestran un porcentaje de identidad de 75% o superior a 75% entre dos cualesquiera de dichas moléculas de ácidos nucleicos codificantes de E2. 2. Vector según la reivindicación 1, en el que dicha(s) molécula(s) de ácidos nucleicos codificante(s) de E2 codifica(n) un polipéptido E2 originado a partir de un HR-HPV seleccionado de entre el grupo constituido por HPV- 16, HPV-18, HPV-30, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-45, HPV-51, HPV-52, HPV-56, HPV-58, HPV-59, HPV-66, HPV-68, HPV-70 y HPV-85, originado preferentemente a partir de HPV-16, HPV-18, HPV-33 o HPV-52 o cualquier combinación de los mismos. 3. Vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que dichas moléculas de ácidos nucleicos se modifican de manera que codifiquen un polipéptido E2 defectuoso para por lo menos una actividad de activación de la replicación y/o de la transcripción. 4. Vector según la reivindicación 3, en el que dicho polipéptido E2 se origina a partir de HPV-16 y comprende la secuencia de aminoácidos representada en SEC ID nº 1, excepto en que por lo menos el residuo Glu en la posición 39 (E39) y/o el residuo Ile en la posición 73 (I73) se sustituye(n) por cualquier residuo aminoácido aparte de Glu e Ile en las posiciones respetivas 39 y 73, preferentemente con un residuo de Ala. 5. Vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dichas moléculas de ácidos nucleicos se modifican de manera que codifiquen un polipéptido E2 presentado en la membrana. 6. Vector según la reivindicación 5, en el que dicho polipéptido E2 presentado en la membrana se modificó mediante fusión de dicho polipéptido E2 de papilomavirus con una secuencia secretora y de anclaje a la membrana, en el que dichas secuencias secretoras y/o de anclaje a la membrana se originan preferentemente a partir de la glucoproteína de virus de la rabia, la glucoproteína de cubierta del virus VIH o la proteína F del virus del sarampión o son sintéticas. 7. Vector según la reivindicación 6, en el que dicha molécula de ácidos nucleicos codifica un polipéptido E2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID nº 2. 8. Vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho vector comprende moléculas de ácidos nucleicos codificantes de por lo menos dos polipéptidos E2 originados a partir de diferentes genotipos de papilomavirus. 9. Vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho vector se selecciona de entre el grupo constituido por: - un vector que comprende (i) una molécula de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido E2 de HPV-16 y que comprende además (ii) una molécula de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido E2 de HPV-18; - un vector que comprende (i) una molécula de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido E2 de HPV-16, (ii) una molécula de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido E2 de HPV-18, e (iii) una molécula de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido E2 de HPV-33; - un vector que comprende (i) una molécula de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido E2 de HPV-16, (ii) una molécula de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido E2 de HPV-18, e (iii) una molécula de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido E2 de HPV-52; - un vector que comprende: (i) una molécula de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido E2 de HPV-16, (ii) una molécula de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido E2 de HPV-33, e (iii) una molécula de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido E2 de HPV-52; - un vector que comprende: (i) una molécula de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido E2 de HPV-16, (ii) una molécula de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido E2 de HPV-18, (iii) una molécula de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido E2 de HPV-33, e (iv) una molécula de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido E2 de HPV-52; - un vector que comprende: (i) una molécula de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido E2 de HPV-16, (ii) una molécula de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido E1 de HPV-16, (iii) una molécula de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido E2 de HPV-18, e (iv) una molécula de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido E1 de HPV-18; 47   - un vector que comprende moléculas de ácidos nucleicos codificantes de los polipéptidos E1, E2, E6 y E7 de HPV-16, y los polipéptidos E1, E2, E6 y E7 de HPV-18. 10. Vector según la reivindicación 9, en el que dicho polipéptido E2 de HPV-16 comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID nº 2; y/o dicho polipéptido E2 de HPV-18 comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID nº 29; y/o dicho polipéptido E2 de HPV-33 comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID nº 30, y/o dicho polipéptido E2 de HPV-52 comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID nº 31. 11. Vector según la reivindicación 9 ó 10, en el que dicho polipéptido E1 de HPV-16 comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID nº 3, y/o dicho polipéptido E1 de HPV-18 comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID nº 32; y/o dicho polipéptido E6 de HPV-16 comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID nº 4; y/o dicho polipéptido E7 de HPV-16 comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID nº 5. 12. Vector según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que dicha molécula de ácidos nucleicos codificante del polipéptido E2 de HPV-16 comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID nº 8 y/o dicha molécula de ácidos nucleicos codificante del polipéptido E2 de HPV-18 comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID nº 33; y/o dicha molécula de ácidos nucleicos codificante del polipéptido E2 de HPV-33 comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID nº 34 o SEC ID nº 35; y/o dicha molécula de ácidos nucleicos codificante del polipéptido E2 de HPV-52 comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID nº 36 o SEC ID nº 37; y/o dicha molécula de ácidos nucleicos codificante del polipéptido E1 de HPV-16 comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID nº 7 y/o dicha molécula de ácidos nucleicos codificante del polipéptido E1 de HPV-18 comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID nº 38. 13. Vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que dicho vector es un vector poxvírico generado a partir de un poxvirus del canario, un poxvirus aviar o un virus Vaccinia, preferentemente un virus Vaccinia seleccionado de entre la cepa Copenhagen, la cepa Wyeth, NYVAC o la cepa Ankara modificada (MVA). 14. Vector según la reivindicación 13, en el que dicho vector vírico es a) derivado de un virus Vaccinia Copenhagen y en el que dicha molécula de ácidos nucleicos se inserta en el gen timidina cinasa, o b) derivado de un virus Vaccinia MVA y en el que dicha molécula de ácidos nucleicos se inserta en la deleción III. 15. Vector según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 14, en el que dicha(s) molécula(s) de ácidos nucleicos codificante(s) de E2 y/o de E7 se sitúa(n) bajo el promotor H5R de Vaccinia y molécula(s) de ácidos nucleicos codificante(s) de E1 y/o de E6 bajo el control del promotor p7.5K. 16. Partícula vírica infecciosa que comprende el vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15. 17. Composición que comprende un vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o partícula vírica infecciosa según la reivindicación 16 o cualquier combinación de las mismas, preferentemente formulada en una forma adecuada para la inyección, en particular mediante la administración intramuscular o subcutánea. 18. Utilización de un vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, una partícula vírica infecciosa según la reivindicación 16, o una composición según la reivindicación 17, en la preparación de un fármaco para el tratamiento de un organismo huésped que sufre una infección persistente por papilomavirus causada por por lo menos un papilomavirus, preferentemente por por lo menos un HR-HPV. 19. Utilización según la reivindicación 18, para el tratamiento de un organismo huésped que sufre una infección causada por por lo menos uno de entre HPV16, HPV31, HPV33, HPV35, HPV52 y HPV58, en la que dicho vector comprende una molécula de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido E2 originado a partir de HPV-16. 20. Utilización según la reivindicación 18, para el tratamiento de un organismo huésped que sufre una infección causada por por lo menos uno de entre HPV-18, HPV-39, HPV-45, HPV-51, HPV-56, HPV-59, HPV-68, HPV-70 y HPV-85, en la que dicho vector comprende una molécula de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido E2 originado a partir de HPV-18. 21. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, en la que el fármaco debe administrarse en una primera serie de administraciones realizada secuencialmente dentro de un periodo de tiempo comprendido entre unos pocos días y 4 semanas, seguido de una segunda serie de administraciones realizada en uno a 6 meses siguientes a la última administración de la primera serie, comprendiendo la primera serie de administraciones preferentemente tres administraciones secuenciales a intervalos semanales y comprendiendo la segunda serie una administración en 5 ó 6 meses siguientes a la primera serie. 22. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, en la que dicho fármaco está destinado a la utilización a) para proporcionar una respuesta antivírica contra por lo menos uno de los papilomavirus infecciosos, o 48   b) para inducir o activar una respuesta inmunológica en un organismo animal o humano. 23. Vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, una partícula vírica infecciosa según la reivindicación 16 o una composición según la reivindicación 17, para la utilización en a) el tratamiento de una infección persistente por papilomavirus en un organismo animal o humano, b) la inducción o activación de una respuesta inmunológica en un organismo animal o humano, o c) la provisión de una respuesta antivírica en un organismo animal o humano. 49     51   52