Proteína de fusión no estructural del virus de la hepatitis C.

Proteína de fusión aislada, que comprende al menos tres polipéptidos NS,

entre ellos los polipéptidos NS3, NS4Ay NS5B, que se originan a partir de un virus de la hepatitis C (VHC), estando configurados dichos polipéptidos NS endicha proteína de fusión en un orden que es distinto del orden en el que aparecen en la configuración nativa,estando situado el polipéptido NS4A en el término N y estando situado NS5B en el término C de dicha proteína defusión.

Proteína de fusión no estructural del virus de la hepatitis C.

El VHC pertenece a la familia Flaviviridae, y es la causa principal de hepatopatías crónicas y hepatitis aguda. La infección vírica por el VHC está asociada con una tasa elevada (54-86%) de cronicidad, la cual, en el 5 a 24% de los casos, evoluciona a cirrosis y subsiguientemente a carcinoma hepatocelular durante un período de 20 a 30 años (McHutchinson, 2004, The American Journal of Managed Care 10, S21-29) . Actualmente, en Europa y en los Estados Unidos de América, el 20-30% de los transplantes hepáticos y el 15-33% de los cánceres hepáticos son atribuibles a infección por el VHC. La Organización Mundial de la Salud estimó en 1999 que alrededor e 170 millones de personas están crónicamente infectadas a nivel mundial por el VHC, y cada año se infectan 3 a 4 millones de personas.

El VHC es un virus de cubierta con un genoma de ácido ribonucleico (ARN) monocatenario positivo de aproximadamente 9.600 nucleótidos, cuya organización es habitual para todas las cepas y aislados del VHC. La traducción del genoma del VHC en la fase 0 genera una gran poliproteína de 3010 a 3030 aminoácidos según el genotipo, que es escindida proteolíticamente por proteasas víricas y celulares para producir 10 proteínas víricas. La tercera parte aminoterminal de la poliproteína codifica las proteínas estructurales del virión: la proteína Core (C) , y las glucoproteínas de cubierta E1 y E2. Después de la región estructural viene una pequeña proteína de membrana integral, p7, que parece funcionar como un canal de iones. El resto del genoma codifica las proteínas no estructurales (NS) NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A y NS5B, que median los procesos intracelulares del ciclo vital del virus (Penin, 2004, Hepatology 39, 5-19) . El VHC también codifica proteínas pequeñas, denominadas F (desplazamiento del marco) o ARFP (proteína del marco de lectura alternativo) , que se pueden producir mediante desplazamiento del marco ribosómico o iniciación interna en un marco de lectura +1 alternativo dentro del gen core (véanse Branch et al., 2005, Semin. Liver Dis. 25:105-117; y el documento WO2004/069864) . Las secuencias que codifican la poliproteína están flanqueadas en ambos extremos por dos regiones no traducidas muy conservadas (UTR) , 5’UTR y 3’UTR, respectivamente. Un sitio de entrada al ribosoma interno, situado en 5’UTR, permite la fijación al ribosoma para la iniciación de la traducción, mientras que se piensa que la 3’UTR desempeña un papel importante en la iniciación de la replicación vírica.

La terapia estándar actual para pacientes infectados crónicamente con VHC es una combinación de interferón alfa pegilado (PEG-IFN-α) y ribavirina (Fried et al., 2002, N. Engl. J. Med. 347, 975-982) . Sin embargo, esta terapia es costosa, está asociada con efectos secundarios significativos que conducen a la terminación prematura del tratamiento en 10% de los casos, y es inadecuada para un número significativo de pacientes (por ejemplo aquellos con cirrosis hepática descompensada, enfermedades autoinmunitarias, antecedentes de depresión y embarazo) . De forma más importante, sólo el 50% de los pacientes tratados responden al tratamiento (Falck-Ytter, et al., 2002, Ann. Intern. Med. 136, 288-292) , y la tasa de respuesta es todavía más baja para pacientes infectados con el genotipo 1 (27%-35%) .

En conjunto, se acumula un número de pruebas experimentales para enfatizar el papel crítico desarrollado por la inmunidad de células T en el control de la infección por VHC, particularmente respuestas mediadas por células T CD4+ y CD8+ dirigidas a las proteínas no estructurales (NS) (por ejemplo Francavilla et al., 2004, Eur. J. Immunol. 34, 427-37; Grakoui et al., 2003, Science 302, 659-662; Shoukr y et al., 2003, J. Exp. Med. 197, 1645-1655; Thimme et al., 2001, J. Exp. Med. 194, 1395-1406; Lechner et al., 2000, J. Exp. Med. 191, 1499-1512; Gerlach, 1999, Gastroenterology 117, 933-941; Folgori et al., 2006, Nat Med. 12, 190-197) . De hecho, se observan respuestas vigorosas de células T específicas del VHC en pacientes que se recuperan espontáneamente de hepatitis C aguda autolimitada, mientras que las respuestas de las células T son débiles y están centradas de forma muy particular en pacientes infectados persistentemente. Por otro lado, el papel desempeñado por los anticuerpos neutralizantes (inmunidad mediada por células B) es mucho menos claro (Logvinoff, 2004, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 1014954) .

Desde el descubrimiento del virus del VHC hace 15 años, todavía no hay ninguna vacuna contra el VHC debido a la dificultad de lograr un crecimiento eficiente del virus en cultivo celular y la falta de modelos de laboratorio fácilmente disponibles de infección vírica. Sin embargo, ahora ha aparecido un gran número de vacunas candidatas (Barth y Baumert, 2004, Novel vaccine strategies, p. 214-227, In State of the Art of Hepatology: Molecular and Cell Biology eds Kluwer Academic Publishers; Inchauspe and Feinstone, 2003, Clin. Liver Dis. 7, 243-259) , que se basan, por ejemplo, en péptidos derivados de VHC (Cerny et al., 1995, J. Clin. Invest. 95, 521-30) , antígenos de VHC producidos recombinantemente, vacunas a base de ADN y de virus (Brinster et al., 2001, Hepatology 34, 1206-1217; Foms et al., 2000, Hepatology 32, 618-625) y partículas semejantes al virus de VHC (Baumert et al., 1999, Gastroenterology 117, 1397-1407; Jeong et al., 2004, J. Virol. 78, 6995-7003) . Actualmente se evalúan varios candidatos en modelos preclínicos, y la primera ola está entrando en ensayos clínicos. Las vacunas más avanzadas actualmente en fase II usan proteína de cubierta E1 con adyuvantes (Innogenetics) y epítopos de células CD4+ y CD8+ con adyuvantes (Intercell) .

Un enfoque que se ha explorado en forma activa durante esta última década se basa en el uso de poliproteínas que asocian diversos dominios antigénicos como inmunógenos. Una amplia mayoría de las poliproteínas de la técnica

anterior resultan de la fusión a otro polipéptido antigénico, fragmentos o epítopos que se originan a partir de diversas proteínas NS de VHC, a fin de formar un único polipéptido esperanzadoramente inmunógeno. Por ejemplo, los documentos WO01/30812 y WO03/031588 describen la fusión de polipéptidos de VHC de NS3 a NS5B para formar un único polipéptido que engloba las proteínas NS principales. El documento WO03/097677 describe la fusión de fragmentos antigénicos de 30 a 70 aminoácidos que se originan a partir de polipéptidos NS3, NS4B y NS5B. El documento WO2004/0461 describe una poliproteína que comprende Core, NS3, NS4B y NS5B. El documento WO2004/1110 describe vectores adenovíricos y de MVA para coexpresar NS3, NS4 y NS5B, en el que NS3 y NS4 son expresadas como una proteína de fusión, y NS5B es expresada independientemente.

Se ha de señalar que la configuración de las poliproteínas de la técnica anterior es como en el contexto nativo, apareciendo los diversos componentes en el orden en el que aparecen de forma natural en el precursor de VHC nativo. En particular, NS3 es seguida de NS4, que es seguida de NS5. Sin embargo, la configuración “nativa” no es óptima en términos de expresión e inmunogenicidad de las poliproteínas resultantes.

Se puede esperar que el VHC continuará siendo una amenaza grave para la salud mundial durante muchos años, debido a la naturaleza crónica y persistente de infección, su elevada prevalencia y la morbidez significativa de las enfermedades asociadas. De este modo, existe una necesidad importante de desarrollar polipéptidos más inmunógenos, vectores de expresión, métodos para la preparación de los mismos, y sus usos, para mejora la prevención y tratamiento de infecciones por VHC o enfermedades o trastornos asociados con VHC.

La presente invención se refiere a proteínas de fusión que implican polipéptidos no estructurales (NS) dispuestos en una configuración no nativa según la reivindicación 1. Se seleccionaron fragmentos específicos para los polipéptidos MS de VHC (por ejemplo NS3, NS4A, NS5B y opcionalmente NS4B) , y se configuraron específicamente a fin de optimizar la inmunogenicidad y/o el procedimiento de producción recombinante de las proteínas de fusión resultantes. En comparación con los polipéptidos NS nativos, las nuevas proteínas de fusión de VHC proporcionadas por la presente invención, o sus secuencias nucleotídicas codificantes, pueden permitir una mejora de una respuesta inmunitaria anti-VHC y/o una mejora de la respuesta citotóxica global con la introducción en un organismo... [Seguir leyendo]

1. Proteína de fusión aislada, que comprende al menos tres polipéptidos NS, entre ellos los polipéptidos NS3, NS4A y NS5B, que se originan a partir de un virus de la hepatitis C (VHC) , estando configurados dichos polipéptidos NS en dicha proteína de fusión en un orden que es distinto del orden en el que aparecen en la configuración nativa, estando situado el polipéptido NS4A en el término N y estando situado NS5B en el término C de dicha proteína de fusión.

2. Proteína de fusión aislada según la reivindicación 1, en la que la fusión entre cada uno de los polipéptidos NS es directa o a través de un ligador.

3. Proteína de fusión aislada según la reivindicación 1 o 2, en la que todos los polipéptidos NS se originan a partir de la misma cepa o aislado de VHC.

4. Proteína de fusión aislada según la reivindicación 1 o 2, en la que al menos dos de los polipéptidos NS se originan a partir de cepas o aislados de VHC diferentes.

5. Proteína de fusión aislada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende un polipéptido NS4A, un polipéptido NS3, un polipéptido NS4B y un polipéptido NS5B.

6. Proteína de fusión aislada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el polipéptido NS3 está modificado en comparación con un polipéptido NS3 nativo, para mostrar una actividad de proteasa significativamente reducida.

7. Proteína de fusión aislada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que el polipéptido NS3 está modificado en comparación con un polipéptido NS3 nativo para mostrar una actividad de helicasa significativamente reducida.

8. Proteína de fusión aislada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que el polipéptido NS5B está modificado en comparación con un polipéptido NS5B nativo para mostrar una actividad de ARN polimerasa dependiente de ARN significativamente reducida.

9. Proteína de fusión aislada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que dicha proteína de fusión no comprende uno o más de los sitios de escisión reconocidos por NS3 normalmente presentes en un precursor poliproteico de VHC nativo en las uniones NS3/NS4A, NS4A/NS4B, NS4B/NS5A y NS5A/NS5B.

10. Proteína de fusión aislada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que los polipéptidos NS4A, NS4B y/o NS5B se modifican para suprimir uno o más dominios hidrófobos que están implicados normalmente en el anclaje a la membrana de los polipéptidos nativos NS4A, NS4B y/o NS5B.

11. Proteína de fusión aislada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que el polipéptido NS3 se origina a partir de la proteína NS3 nativa mostrada en la SEC ID nº: 1 que se modifica al menos de tal manera que:

o retiene la porción que se extiende desde la posición 12 hasta la posición 56, desde la posición 70 hasta la posición 155, y desde la posición 218 hasta la posición 248;

o comprende la sustitución del resto His en la posición 57 por un resto de aminoácido diferente de una His, tal como un resto Ala;

o comprende la sustitución del resto Thr en la posición 269 por un resto de aminoácido diferente de una Thr, tal como un resto Ala; y

o comprende la sustitución del resto Arg en la posición 464 por un resto de aminoácido diferente de una Arg, tal como un resto Ala; y

o no comprende el resto Thr en la posición 631.

12. Proteína de fusión aislada según la reivindicación 11, en la que el polipéptido NS3 comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID nº: 5.

13. Proteína de fusión aislada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la que el polipéptido NS4A se origina a partir de la proteína NS4A nativa mostrada en la SEC ID nº: 2 que se modifica al menos de tal manera que:

o contiene la porción de la SEC ID nº: 2 desde la posición 21 hasta la posición 33;

o no contiene la porción de la SEC ID nº: 2 desde la posición 1 hasta la posición 20.

14. Proteína de fusión aislada según la reivindicación 13, en la que el polipéptido NS4A consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID nº: 6 precedida de un resto Met iniciador.

15. Proteína de fusión aislada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en la que el polipéptido NS4B se origina a partir de la proteína NS4B nativa mostrada en la SEC ID nº: 3 que se modifica al menos de tal manera que:

o comprende la porción que se extiende desde el resto Ser en la posición 78 hasta el resto Leu en la posición 109;

o no comprende el resto Cys en la posición 261.

16. Proteína de fusión aislada según la reivindicación 15, en la que el polipéptido NS4B opcional consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos tal como se muestra en la SEC ID nº: 7.

17. Proteína de fusión aislada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en la que el polipéptido NS5B se origina a partir de la proteína nativa NS5B mostrada en la SEC ID nº: 4 que se modifica al menos de tal manera que:

o comprende la porción que se extiende desde el resto Arg en la posición 155 hasta el resto Leu en la posición

182.

o comprende la sustitución del resto Asp en la posición 220 por un resto de aminoácido diferente de una Asp, tal como un resto Asn;

o comprende la sustitución del resto Asp en la posición 318 por un resto de aminoácido diferente de una Asp, tal como un resto Asn;

o no comprende la porción que se extiende desde el resto Trp en la posición 571 hasta el resto Arg en la posición 591.

18. Proteína de fusión aislada según la reivindicación 17, en la que el polipéptido NS5B comprende la secuencia de aminoácidos tal como se muestra en la SEC ID nº: 8.

19. Proteína de fusión aislada según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 18, en la que dicha proteína de fusión comprende una secuencia de aminoácidos que es homóloga o idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID nº: 9 o 10.

20. Molécula de ácido nucleico aislada que codifica la proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19.

21. Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 20, que comprende una secuencia nucleotídica optimizada para la expresión en una célula hospedante de mamífero.

22. Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 21, que comprende una secuencia nucleotídica que es homóloga o idéntica a las secuencias nucleotídicas mostradas en la SEC ID nº: 11 o la SEC ID nº: 12.

23. Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 20, que tiene una secuencia nucleotídica optimizada para la expresión en una célula hospedante de levadura.

24. Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 23, en la que la célula hospedante de levadura se selecciona de entre el grupo constituido por Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pombe y Pichia pastoris.

25. Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 24, que comprende una secuencia nucleotídica que es homóloga o idéntica a las secuencias nucleotídicas mostradas en la SEC ID nº: 13 o la SEC ID nº: 14.

26. Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 20, que tiene una secuencia nucleotídica optimizada para la expresión en una célula hospedante procariota.

27. Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 26, que comprende una secuencia nucleotídica que es homóloga o idéntica a las secuencias nucleotídicas mostradas en la SEC ID nº: 15 o la SEC ID nº: 16.

28. Vector que comprende una o más copias de la molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 27.

29. Partícula vírica infecciosa que comprende la molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 27 o el vector de la reivindicación 28.

30. Célula hospedante que comprende la molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 27 o el vector de la reivindicación 28 o la partícula vírica infecciosa de la reivindicación 29.

31. Método para producir recombinantemente la proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, que comprende:

(a) introducir el vector según la reivindicación 28 o la partícula vírica infecciosa según la reivindicación 29 en una célula hospedante para producir una célula hospedante transfectada o infectada según la reivindicación 30,

(b) cultivar in vitro dicha célula hospedante transfectada o infectada, en condiciones adecuadas para el crecimiento de la célula hospedante,

(c) recuperar la proteína de fusión del cultivo celular, y

(d) opcionalmente, purificar la proteína de fusión recuperada.

32. Composición que comprende la proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, la molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 27, el vector según la reivindicación 28, la partícula vírica infecciosa según la reivindicación 29, la célula hospedante según la reivindicación 30, o cualquier combinación de los mismos.

33. Proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, la molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 27, el vector según la reivindicación 28, la partícula vírica infecciosa según la reivindicación 29, la célula hospedante según la reivindicación 30 o la composición según la reivindicación 32, para su uso en el tratamiento o prevención de infecciones por VHC, enfermedades y estados patológicos asociados a VHC.

34. Proteína de fusión, molécula de ácido nucleico, vector, partícula vírica infecciosa, célula hospedante, o composición según la reivindicación 33, en los que dicho uso se lleva a cabo según una modalidad terapéutica de sensibilización y revacunación.

35. Composición según la reivindicación 33, en la que se usa para sensibilizar o estimular, o tanto sensibilizar como estimular, una respuesta inmunitaria anti-VHC.

36. Proteína de fusión, molécula de ácido nucleico, vector, partícula vírica infecciosa, célula hospedante, o composición según cualquiera de las reivindicaciones 33 a 35, en los que dicho uso se lleva a cabo conjuntamente con una quimioterapia con uno o más fármacos contra VHC.

Fig.1

Secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión NS4A-3-5B

Fig. 2

Secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión NS4A-3-4B-5B

Fig. 3

Proteína de fusió.

4. 3-5B_ (Hs)

Fig. 4

Proteína de fusió.

4. 3-4B-5B (Hs) optimizada para Homo sapiens

Fig. 5

Proteína de fusió.

4. 3-5B optimizada para la expresión en: Pichia pastoris

Fig. 6

Proteína de fusió.

4. 3-4B-5B optimizada para la expresión en Pichia pastoris

Fig. 7

Proteína de fusió.

4. 3-5B optimizada para Escherichia coli

Fig. 8

Proteína de fusió.

4. 3-4B-5B optimizada para Escherichia coli