Composición que comprende la poliproteína NS3/NS4 y el polipéptido NS5b del VHC, vectores de expresión que incluyen las secuencias nucleicas correspondientes y su utilización terapéutica.

Principio activo seleccionado de entre el grupo constituido por:

- una composición peptídica que comprende una poliproteína NS3/NS4 del virus de la hepatitis C, así como unpolipéptido NS5b del virus de la hepatitis C;

- un vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una poliproteína NS3/NS4 delvirus de la hepatitis C y una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido NS5b del virus de la hepatitisC; y

- un vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una poliproteína NS3/NS4 delvirus de la hepatitis C así como los medios necesarios para su expresión con un vector de expresión quecomprende una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido NS5b del virus de la hepatitis C, así comolos medios necesarios para su expresión,

para su utilización en una cantidad terapéuticamente eficaz en el tratamiento de la infección persistente por VHC ocáncer hepático en pacientes infectados con VHC, o para disminuir o ralentizar la inflamación hepática, la esteatosiso la fibrosis asociada a la infección por VHC, en el que el tratamiento comprende por lo menos tres administracionessecuenciales de dicho principio activo separadas entre sí por un período de tiempo que varía de 3 a 10 días.

Composición que comprende la poliproteína NS3/NS4 y el polipéptido NS5b del VHC, vectores de expresión que incluyen las secuencias nucleicas correspondientes y su utilización terapéutica.

La presente invención se define en las reivindicaciones, y se refiere al campo de la vacunación profiláctica y terapéutica dirigida contra el virus de la hepatitis C (VHC) . Se refiere en particular a una nueva composición que contiene una poliproteína que corresponde a las dos proteínas colineales NS3 y NS4 (denominadas en adelante poliproteína NS3/NS4) y un polipéptido constituido por NS5b, los vectores, tales como adenovirus o poxvirus, capaces de expresar esta composición y su utilización como vacuna.

La hepatitis C es la causa principal de las hepatitis adquiridas por transfusión. La hepatitis C se puede transmitir asimismo por otras vías percutáneas, por ejemplo por inyección de drogas por vía intravenosa. Además, el riesgo de contaminación de los profesionales de la salud no es despreciable. La transmisión sexual ya ha sido descrita.

La hepatitis C se distingue de las demás formas de enfermedades del hígado asociadas a virus, tales como la hepatitis A, B o D. Las infecciones por el virus de la hepatitis C (VHC o HCV) son mayoritariamente crónicas, dando como resultado enfermedades del hígado, tales como hepatitis, cirrosis y carcinoma en un gran número de casos (5 a 20%) y representan en los países desarrollados 30% de los transplantes hepáticos.

Aunque el riesgo de transmisión del virus por transfusión haya disminuido por el establecimiento de ensayos de cribado en los años 1990, la frecuencia de nuevas infecciones por la hepatitis C sigue siendo elevada. A título de ejemplo, un estudio reciente indica que existen todavía en la actualidad 10.000 a 15.000 nuevos casos de infección por año en Francia (S. Deuffic et al., Hepatology 1999; 29: 1596-1601) . Actualmente, aproximadamente 170 millones de personas en todo el mundo están infectadas de manera crónica por el VHC (Hepatitis C: Global prevalence (actualización) , 2000, Weekly Epidermiological Record, Vol. 75 (3) ) . Las poblaciones con riesgo elevado son principalmente el personal hospitalario y los usuarios de drogas intravenosas, pero existen donantes de sangre asintomáticos que no pertenecen a estos grupos de riesgo elevado y en los que se han encontrado anticuerpos anti-VHC circulantes. Para estos últimos, no se ha identificado todavía la vía de infección. Existen por lo tanto unas infecciones por VHC (estimación de entre 5 y 10%) , denominadas infecciones esporádicas, cuya etiología no se conoce y que no pueden ser controladas.

El VHC ha sido el primer virus hepatótropo aislado por medio de técnicas de biología molecular. Las secuencias del genoma vírico fueron clonadas antes de que la partícula vírica fuese visualizada.

El VHC pertenece a un nuevo género de la familia de las Flaviviridae, los hepacivirus. Es un virus de ARN monocatenario positivo, de 9, 5 kb, que se replica mediante una copia de ARN complementario, y cuyo producto de traducción es un precursor poliproteico de aproximadamente 3.000 aminoácidos. El extremo 5’ del genoma del VHC corresponde a una región no traducida adyacente a los genes que codifican para las proteínas estructurales, la proteína nuclear de la nucleocápside, las dos glicoproteínas de cubierta, E1 y E2, y una pequeña proteína denominada p7. La región no traducida 5’ y el núcleo génico están relativamente bien conservados en los distintos genotipos. Las proteínas de cubierta E1 y E2 están codificadas por regiones que son más variables de un aislado a otro. La proteína p7 es una proteína extremadamente hidrófoba que constituiría un canal iónico. El extremo 3’ del genoma del VHC contiene los genes que codifican para las proteínas no estructurales (NS2, NS3, NS4, NS5) y para una región 3’ no codificante que posee un dominio bien conservado (Major ME, Feinstone SM, Hepatology, junio de 1997, 25 (6) :1527-1538) .

En la actualidad, la terapia más eficaz para el tratamiento de la hepatitis C asocia el interferón pegilado y la ribavirina (Manns MP et al., The Lancet, 22 de septiembre de 2001, Vol. 358, 958-965) . Mientras que esta terapia es particularmente eficaz en el caso de pacientes infectados por cepas víricas que pertenecen a los genotipos 2 y 3, ésta tiene solamente un efecto limitado sobre los genotipos 1a, 1b y 4 (Manns MP, obra citada) . Menos del 50% de los pacientes tratados resultan unos “respondedores a largo plazo”. Por otra parte, esta terapia es una intervención costosa (10.000 a 15.000 euro/paciente/año) y está asociada con unos efectos tóxicos. De hecho, 5 a 10% de los pacientes están obligados a interrumpir el tratamiento antes del final.

Por lo tanto, es necesario desarrollar una composición vacunal que tiene como diana todos los genotipos.

Varios estudios muestran que el control de una infección debida al VHC, ya sea naturalmente (“resolución espontánea”) o bien después del tratamiento (“resolución terapéutica”) , está asociada a la inducción o la potencialización de respuestas inmunitarias mediadas celularmente, implicando los linfocitos T-CD4+ y T-CD8+ (tal como se describe, por ejemplo, en LECHNER, F. et al., Eur. J. Immunol., 30:2479-2487 (2000) y en Thimme R. et al., 2001, J. Exp. Med., 194 (10) : 1395-1406) .

Las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC, también denominado HLA en seres humanos) son denominadas de clase I o de clase II. Las moléculas de clase I se expresan en la casi totalidad de las células nucleadas y son capaces de presentar epítopos o péptidos a los linfocitos T citotóxicos (CTL) CD8+. Las moléculas

de clase II son capaces de presentar epítopos a las células T CD4+, pero su expresión está restringida a las células presentadoras de antígeno.

Las vacunas contra el virus de la hepatitis C previstas actualmente se basan en la utilización de proteínas recombinantes adyuvantes, de péptidos, de vectores de expresión entre los cuales se pueden citar los vectores de origen vírico o bacteriano o de ADN desnudo. En este caso, se usa una o más proteínas víricas o uno o más genes que codifican estas proteínas víricas.

Cuando se seleccionan varias proteínas víricas o uno o más genes que codifican estas proteínas víricas, están frecuentemente constituidas por una parte o por todas las proteínas estructurales (Makimura et al., 1996, Vaccine,

14: 28-34; Fournillier A., et al, 1999, J. Virology, 73: 7497-7504) , o bien por proteínas no estructurales individuales o que comprenden por lo menos dos proteínas contiguas (Brinster et al., 2001, Hepatology, 34: 1206-1217) , o bien por una mezcla de proteínas estructurales y no estructurales (Pancholi et al., 2003, J. Virology, 77:382-390) .

La solicitud de patente WO 99/38880 describe el uso de tres genes que codifican separadamente las tres proteínas NS3, NS4 y NS5 (a y b) en una composición vacunal que comprende tres vacunas ADN que expresan cada una separadamente estas tres proteínas. Los autores muestran en ratones la inducción de linfocitos T específicos de los tres antígenos. Sólo la vacuna que expresa NS5a y b ha sido ensayada in vivo en un ensayo de protección.

La solicitud de patente WO 01/30812 describe el uso de una proteína de fusión constituida por las proteínas no estructurales NS3, NS4 y NS5a, llegado el caso en asociación con la proteína no estructural NS5b. Los autores han indicado que esta combinación permitía activar las células T específicas de VHC. Esta solicitud de patente describe simplemente la capacidad de formulaciones vacunales (tipo ADN desnudo, adenovirus recombinante o virus de la vacuna recombinante) que expresan la proteína de fusión NS3, NS4 y NS5a o la proteína NS5a para inducir unas respuestas inmunitarias específicas mediadas por linfocitos T específicos.

El documento WO04/111082 describe que una combinación particular de las proteínas no estructurales NS3, NS4 y NS5b, siendo NS3 y NS4 expresadas de manera colineal, tuvo un mejor poder inmunógeno y protector superior al obtenido con una vacuna que también incluye, además de estas proteínas no estructurales, la proteína NS5a y/u otras proteínas estructurales del VHC tal como core, E1 o E2, y tuvo un efecto sobre la capacidad de las células que proceden de pacientes infectados por cepas víricas para inducir respuestas inmunitarias específicas.

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1. Principio activo seleccionado de entre el grupo constituido por:

- una composición peptídica que comprende una poliproteína NS3/NS4 del virus de la hepatitis C, así como un polipéptido NS5b del virus de la hepatitis C;

- un vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una poliproteína NS3/NS4 del virus de la hepatitis C y una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido NS5b del virus de la hepatitis C; y

- un vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una poliproteína NS3/NS4 del virus de la hepatitis C así como los medios necesarios para su expresión con un vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido NS5b del virus de la hepatitis C, así como los medios necesarios para su expresión,

para su utilización en una cantidad terapéuticamente eficaz en el tratamiento de la infección persistente por VHC o cáncer hepático en pacientes infectados con VHC, o para disminuir o ralentizar la inflamación hepática, la esteatosis

o la fibrosis asociada a la infección por VHC, en el que el tratamiento comprende por lo menos tres administraciones secuenciales de dicho principio activo separadas entre sí por un período de tiempo que varía de 3 a 10 días.

2. Composición farmacéutica o kit que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un principio activo seleccionado de entre el grupo constituido por:

- una composición peptídica que comprende una poliproteína NS3/NS4 del virus de la hepatitis C así como un polipéptido NS5b del virus de la hepatitis C;

- un vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una poliproteína NS3/NS4 del virus de la hepatitis C y una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido NS5b del virus de la hepatitis C; y

- un vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una poliproteína NS3/NS4 del virus de la hepatitis C así como los medios necesarios para su expresión con un vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido NS5b del virus de la hepatitis C así como los medios necesarios para su expresión;

para la administración secuencial de dicha cantidad terapéuticamente eficaz de un principio activo para su utilización en el tratamiento de la infección persistente por VHC o del cáncer hepático en pacientes infectados por VHC, o para su utilización para disminuir o ralentizar la inflamación hepática, la esteatosis o la fibrosis asociada con la infección por VHC, en particular en la forma de por lo menos 3 administraciones secuenciales separadas entre sí por un período de tiempo que varía de 3 a 10 días, siendo dicha cantidad terapéuticamente eficaz de un principio activo de manera que está acondicionada preferentemente para 3 administraciones, más preferentemente en 3 viales diferentes, separándose preferentemente dichas administraciones entre sí por un período de tiempo que varía desde 3 a 10 días.

3. Principio activo para su utilización según la reivindicación 1 o composición farmacéutica o kit para su utilización según la reivindicación 2, en el que dichas NS3 y/o NS4 y/o NS5b se originan del mismo genotipo de VHC, o en el que dichas secuencias nucleotídicas que codifican la poliproteína NS3/NS4 y el polipéptido NS5b se originan a partir del mismo genotipo de VHC, preferentemente el genotipo 1b.

4. Principio activo o composición farmacéutica o kit farmacéutico para su utilización según la reivindicación 3, en el que dicha poliproteína NS3/NS4 comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID nº: 2.

5. Principio activo o composición farmacéutica o kit farmacéutico para su utilización según la reivindicación 3 ó 4, en el que dicho polipéptido NS5b comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID nº: 4.

6. Principio activo para su utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3 a 5 o composición farmacéutica

o kit para su utilización según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en el que dicho vector de expresión es un poxvirus, preferentemente un MVA.

7. Principio activo o composición farmacéutica o kit para su utilización según la reivindicación 6, en el que dicho vector de expresión comprende un genoma de MVA que se modifica para insertar el casete de expresión ph5r-NS3-NS4 y para insertar el casete de expresión p7.5-NS5b, preferentemente en la misma orientación y en la supresión III.

8. Principio activo o composición farmacéutica o kit para su utilización según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 7, en el que dicho principio activo comprende de 106 a 108 pfu de vector poxvírico o de MVA.

9. Principio activo para su utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3 a 8 o composición farmacéutica

o kit para su utilización según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, en el que dichas por lo menos tres administraciones secuenciales se llevan a cabo en un intervalo de aproximadamente una semana.

10. Principio activo para su utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3 a 9 o composición farmacéutica

o kit para su utilización según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9, en el que dicha utilización o patrón de administración comprende además por lo menos una administración de recuerdo llevada a cabo por lo menos 4 semanas después de la última de las series de administraciones secuenciales.

11. Principio activo o composición farmacéutica o kit para su utilización según la reivindicación 10, en el que dichas administraciones secuenciales y de recuerdo y dicha administración de recuerdo usan el mismo principio activo, que es preferentemente como se define en cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8.

12. Principio activo o composición farmacéutica o kit para su utilización según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 11, en el que dicha administración de recuerdo se lleva a cabo a aproximadamente 4 meses o 6 meses después de la última de las series de administraciones secuenciales.

13. Principio activo o composición farmacéutica o kit para su utilización según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en el que dicha utilización o patrón de administración comprende tres administraciones a un intervalo de aproximadamente una semana, y una administración de recuerdo ya sea aproximadamente 4 meses o 6 meses después de la última de las series de administraciones secuenciales.

14. Principio activo o composición farmacéutica o kit para su utilización según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en el que dicha utilización o patrón de administración comprende tres administraciones a un intervalo de aproximadamente una semana y dos administraciones de recuerdo a aproximadamente 4 meses y aproximadamente 6 meses después de la última de las series de las administraciones secuenciales.

15. Principio activo o composición farmacéutica o kit para su utilización según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, en el que dichas administraciones secuenciales y de recuerdo se llevan a cabo mediante la misma vía de administración, preferentemente seleccionadas de entre el grupo constituido por las vías intramuscular, subcutánea, transdérmica, oral, sublingual y tópica.

16. Principio activo o composición farmacéutica o kit para su utilización según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, en el que dichas administraciones secuenciales y de recuerdo se llevan a cabo mediante diferentes vías de administración, preferentemente seleccionadas de entre el grupo constituido por las vías intramuscular, subcutánea, transdérmica, oral, sublingual y tópica.

17. Composición farmacéutica para su utilización según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 16, caracterizada porque comprende asimismo un vehículo farmacéuticamente apropiado.

18. Kit farmacéutico para su utilización según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 16, caracterizado porque comprende por lo menos 4 viales diferentes que comprenden una cantidad eficaz de un principio activo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8, en el que 3 viales son para 3 administraciones secuenciales separadas entre sí por un período de tiempo que varía de 3 a 10 días, y el 4º vial es para una administración de recuerdo llevada a cabo por lo menos 4 semanas después de la última de las 3 administraciones secuenciales.

19. Principio activo para su utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3 a 16 o composición farmacéutica o kit para su utilización según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 18, en el que dicha utilización o patrón de administración se lleva a cabo conjuntamente con tratamiento del organismo hospedante con IFN-α2 pegilado y/o ribavirina.

20. Principio activo para su utilización según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 17 y 19, en el que dicha utilización o patrón de administración es para estimular una respuesta inmunitaria celular específica para VHC, y en el que dicha respuesta inmunitaria estimulada es una respuesta de célula T CD8+, una respuesta de célula T CD4+,

o respuestas de células T tanto CD8+ como CD4+ T, preferentemente dirigidas a un epítopo localizado en una proteína NS3 y/o NS4 y/o NS5B.

21. Principio activo para su utilización según la reivindicación 20, en el que dicho epítopo es a) restringido a HLA-B7 y está localizado en el polipéptido NS3 del virus de la hepatitis infeccioso, o b) restringido a HLA-A2 y está localizado en la proteína NS3 y/o NS5b del virus de la hepatitis infeccioso.

22. Principio activo para su utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 a 16 y 19 a 21 o composición farmacéutica o kit para su utilización según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 19, en el que dicho virus de la hepatitis C infeccioso es del genotipo 1a o 1b.