Vectores oncolíticos poxvirales.

Un poxvirus que comprende un gen F2L defectuoso, un gen J2R defectuoso y un ácido nucleico de interés que comprende un gen suicida.

Vectores oncolíticos poxvirales Campo técnico

Los virus oncolíticos son una clase de nuevos agentes terapéuticos usados para el tratamiento del cáncer que tienen la propiedad única de auto-perpetuación dependiente de tumor (HERMISTON. A demand for next-generation oncolytic adenoviruses. Current opinión in molecular therapeutics. 26, vol.8, n° 4, p.322-3.). Los virus oncolíticos tienen capacidad de replicación selectiva en células malignas y por lo tanto ofrecen niveles de potencia y especificidad que son potencialmente mucho más altos que los tratamientos convencionales para el cáncer (FISHER. Striking out at disseminated metastases: the systemic delivery of oncolytic viruses. Current opinión in molecular therapeutics. 26, vol.8, n° 4, p.31-13.). El beneficio de usar estos virus es que como se replican, lisan sus células huésped. Las células cancerosas son huéspedes ideales para muchos virus porque tienen la vía de interferón antiviral inactivada y tienen genes supresores tumorales mutados que posibilitan que avance la replicación viral de forma no impedida (CHERNAJOVSKY, y col. Fighting cáncer with oncolytic viruses. British medical journal. 26, vol.332, n° 7534, p.17-2.).

Algunos virus son capaces de forma natural de replicarse de forma selectiva en células tumorales pero los virus oncolíticos también pueden obtenerse modificando virus de origen natural. Para este fin, las estrategias principales usadas actualmente para modificar los virus incluyen: deleciones funcionales en genes virales esenciales; promotores específicos de tumor o tejido usados para controlar la expresión de estos genes virales; y modificación de tropismo para redirigir el adenovirus a la superficie de la célula cancerosa. En un futuro cercano, los adenovirus oncolíticos tienen que optimizarse para conseguir completamente su potencial como herramientas antineoplásicas críticas y, por tanto, mejorar el pronóstico de pacientes con gliomas malignos (JIANG, y col. Oncolytic adenoviruses as antiglioma agents. Expert review of anticancertherapy. 26, vol.6, n° 5, p.697-78.).

Por ejemplo, ONYX-15, un adenovirus modificado selectivamente para replicarse en y eliminar células que albergan mutaciones p53, está en desarrollo por Onyx Pharmaceuticals para el tratamiento potencial de diversos tumores sólidos, incluyendo tumores de cabeza y cuello, gastrointestinales y pancreáticos. Es un adenovirus recombinante que porta una mutación de pérdida de función en el locus E1 B, cuyo producto es una proteína de 55 kDa que se une a e inactiva la proteína supresora tumoral p53. Por tanto, se supone que el adenovirus ONYX-15 deje las células normales sin afectar. Las mutaciones en el gen supresor tumoral p53 son el tipo más común de anormalidad genética en el cáncer, sucediendo en más de la mitad de todos los tipos de cáncer principales. Por tanto, estas células son susceptibles al virus, que se replicarán fácilmente y causarán muerte celular. ONYX-15 está en ensayos en fase III en curso para el tratamiento de cáncer recurrente de cabeza y cuello, ensayos en fase II para tumores colorrectales, de ovario, páncreas y boca, y ensayos en fase I para enfermedad digestiva, tumores de esófago e hígado (COFIEN, y col. ONYX-15. Onyx Pharmaceuticals. Current opinión in investigational drugs. 21, vol.2, n° 12, p.177-5.).

Los virus oncolíticos de forma natural son virus competentes en replicación que tienen una capacidad innata de infectar selectivamente y eliminar células tumorales. A pesar de usarse en los intentos originales por tratar el cáncer con virus vivos hace ya cinco décadas, el interés en los virus oncolíticos de forma natural ha ido a la zaga del apoyo por adenovirus modificados por ingeniería y herpes virus como agentes terapéuticos contra el cáncer. Recientemente, sin embargo, se ha renovado el interés en la elevada potencia y selectividad de estos agentes de origen natural (ROBERTS, y col. Naturally oncolytic viruses. Current opinión in molecular therapeutics. 26, vol.8, n° 4, p.314-21.).

Entre los virus oncolíticos de forma natural, los virus Vaccinia (un Poxviridae) poseen muchos de los atributos clave necesarios para una estructura viral ideal para su uso en viroterapia oncolítica. Estos incluyen un ciclo de vida corto, con rápida propagación célula a célula, fuerte capacidad lítica, una gran capacidad de clonación y biología molecular bien definida. Además, aunque son capaces de replicarse en células humanas, no se consideran un problema natural para la salud y están especialmente bien caracterizados, habiéndose suministrado a millones de individuos durante la campaña para erradicar la viruela. Los resultados clínicos prematuros usando cepas de vacuna o cepas vaccinia modificadas genéticamente han demostrado efectos antitumorales (TFIORNE, y col. Vaccinia virus and oncolytic virotherapy of cáncer. Current opinión in molecular therapeutics. 25, vol.7, n°4, p.359-65.).

En contraste, el poxvirus virus de mixoma es un nuevo candidato oncolítico que no tiene historial de uso en seres humanos directamente, ya que tiene un tropismo de especie huésped distinto y absoluto por lagomorfos (conejos). El virus de mixoma ha demostrado recientemente ser capaz también de infectar selectivamente y eliminar células tumorales humanas, un tropismo único que está ligado a vías de señalización intracelular mal reguladas encontradas en la mayoría de los cánceres humanos. Esta revisión resume el conocimiento existente sobre el tropismo del virus de mixoma por células cancerosas humanas, así como datos preclínicos que muestra su capacidad de infectar y eliminar tumores en modelos animales de cáncer (STANFORD, y col. Myxoma virus and oncolytic virotherapy: a new biologic weapon in the war against cáncer. Expert opinión on biological therapy. 27, vol.7, n° 9, p.1415-25.).

Problema técnico

La inyección de elevadas dosis de Poxvirus necesarias para conseguir un efecto antitumoral creó problemas de toxicidad. La mayoría de los acontecimientos adversos son reacciones adversas minoritarias que están habitualmente ligadas al virus Vaccinia, están auto-limitadas e incluyen fiebre, cefalea, fatiga, mialgia, escalofríos, reacciones cutáneas locales, erupciones no específicas, eritema multiforme, linfadenopatía, y dolor en el sitio de la vacunación. Otras reacciones podrían requerir terapias adicionales (por ejemplo, VIG, una terapia de primera línea y cidofovir, una terapia de segunda línea). Las reacciones adversas que podrían requerir evaluación adicional o terapia incluyen inoculación accidental, vaccinia generalizada (GV), eccema vaccinatum (EV), vaccinia progresiva (PV), enfermedad del sistema nervioso central después de vacuna, y vaccinia fetal (CONO, y col. Smallpox vaccination and adverse reactions. Guidance for clinicians. MMWR. Recommendations and reports: Morbidity and mortality weekly report. Recommendations and reports / Centers for Disease Control. 23, vol.52, n° RR-4, p.1-28.).

Por tanto, existe la necesidad de poxvirus más seguros con actividad oncolítica tan buenos como sus equivalentes naturales.

Técnica antecedente

El documento US 5364773 (VIROGENETICS CORPORATION (TROY, NY)) 15/11/1994 describe un poxvirus recombinante modificado, más particularmente un virus vaccinia que tiene funciones genéticas codificadas por el virus no esenciales inactivadas de modo que el poxvirus recombinante tiene virulencia atenuada y seguridad potenciada. En particular, las funciones genéticas se inactivan delecionando una fase de lectura abierta que codifica un factor de virulencia o por inactivación de inserción de una fase de lectura abierta que codifica un factor de virulencia. Más particularmente, esta patente describe un virus vaccinia en que la fase de lectura abierta para J2R, B13R+B14R, A26L, A56R, C7L - K1L, y I4L se ha inactivado. Este virus (NYVAC) puede modificarse por ingeniería como un vector para un ácido nucleico foráneo y usarse como una vacuna para inducir una respuesta inmunológica en un animal huésped. Sin embargo, N YVAC es incapaz de replicarse de forma eficaz en la mayoría de las células de mamífero y no puede usarse como virus oncolítico (XIANGZHI, y col. Vaccinia virus K1 L protein supports viral replication in human and rabbit cells through a cell-type-specific set of its ankyrin repeat residues that are distinct from its binding site for ACAP2. Journal of virology. 26, vol.353, n° 1, p.22-233.).

El documento WO 24/14314 (KIRN DAVID (US)) 19/2/24 describe un virus vaccinia alterado que comprende una o más mutaciones en su genoma viral. Se describen mutaciones en una o más de las siguientes clases de polipéptidos: 1) polipéptido modulador de interferón; 2) polipéptido de control del complemento; 3) polipéptido modulador de TNF o... [Seguir leyendo]

1. Un poxvirus que comprende un gen F2L defectuoso, un gen J2R defectuoso y un ácido nucleico de interés que comprende un gen suicida.

2. El poxvirus de acuerdo con la reivindicación 1 en el que dicho poxvirus pertenece a la subfamilia Chordopoxvirinae.

3. El poxvirus de acuerdo con la reivindicación 2 en el que dicho poxvirus pertenece a la especie de virus Vaccinia.

4. El poxvirus de acuerdo con la reivindicación 3 en el que dicho poxvirus es el virus Vaccinia cepa WR.

5. El poxvirus de acuerdo con la reivindicación 3 en el que dicho poxvirus es un virus Vaccinia cepa Copenhagen.

6. El poxvirus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en el que dicho gen suicida codifica una

proteína que tiene al menos una actividad citosina desaminasa.

7. El poxvirus de acuerdo con la reivindicación 6 en el que dicho gen suicida es FCY1, FCA1 o CodA o un análogo de los mismos.

8. El poxvirus de acuerdo con la reivindicación 6 en el que dicha proteína que tiene al menos una actividad citosina desaminasa es el polipéptido FCU1-8 representado en el identificador de secuencias SEC ID N°:2 y análogos del mismo.

9. El poxvirus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en el que dicho gen suicida codifica una proteína que tiene al menos una actividad citosina desaminasa y una actividad uracilo fosforribosil transferasa.

1. El poxvirus de acuerdo con la reivindicación 9 en el que dicho gen suicida codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos sustancialmente como la representada en el identificador de secuencias SEC ID N°: 3 (coda::upp), SEC ID N°: 1 (FCU1) o la secuencia de aminoácidos de FCY1::FUR1.

11. El poxvirus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 en el que dicho poxvirus comprende adicionalmente una secuencia de ácido nucleico que comprende un gen que codifica una permeasa.

12. El poxvirus de acuerdo con la reivindicación 11 en el que la permeasa es una purina o una citosina permeasa de S. cerevisiae.

13. El poxvirus de acuerdo con la reivindicación 12 en el que la permeasa se elige entre el grupo que comprende FCY2 y Fur4 y análogos de las mismas.

14. El poxvirus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 en el que dicho poxvirus comprende adicionalmente los elementos necesarios para la expresión del ácido nucleico de interés.

15. El poxvirus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13 en el que dicho poxvirus comprende adicionalmente los elementos necesarios para la expresión de la secuencia de ácido nucleico que comprende un gen que codifica una permeasa.

16. El poxvirus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 para su uso en el tratamiento de una enfermedad proliferativa o una enfermedad asociada con una actividad aumentada de osteoclastos.

17. Un proceso de preparación de un poxvirus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en cuyo proceso:

(i) un poxvirus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 se introduce en una célula;

(¡i) dicha célula es cultivada en condiciones que son apropiadas para posibilitar que dicho poxvirus se produzca,

y;

(iii) dicho poxvirus es recuperado del cultivo celular.

18. Una composición farmacéutica que comprende un poxvirus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

19. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 18 que comprende adicionalmente una o más sustancias que potencian el efecto citotóxico de la 5-Fluorocitosina.

2. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 19 en la que dichas sustancias que potencian el efecto citotóxico de la 5-Fluorocitosina son fármacos que inhiben las enzima de la vía para la biosíntesis de novo de las pirimidinas, preferentemente seleccionadas entre el grupo que consiste en PALA, Leflunomida y A771726.

21. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 19 en la que dicha sustancia que potencia el efecto citotóxico de la 5-Fluorocitosina es metotrexato.

22. La composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21 para su uso en el tratamiento de una enfermedad proliferativa o una enfermedad asociada con una actividad aumentada de osteoclastos.

23. El poxvirus para su uso en el tratamiento de una enfermedad proliferativa o una enfermedad asociada con una 5 actividad aumentada de osteoclastos de acuerdo con la reivindicación 16 o la composición farmacéutica para su uso

en el tratamiento de una enfermedad proliferativa o una enfermedad asociada con una actividad aumentada de osteoclastos de acuerdo con la reivindicación 22, en el que la enfermedad proliferativa es cáncer o restenosis.

24. El poxvirus para su uso en el tratamiento de una enfermedad proliferativa o una enfermedad asociada con una actividad aumentada de osteoclastos de acuerdo con la reivindicación 16 o la composición farmacéutica para su uso

en el tratamiento de una enfermedad proliferativa o una enfermedad asociada con una actividad aumentada de osteoclastos de acuerdo con la reivindicación 22, en el que la enfermedad asociada con una actividad aumentada de osteoclastos es artritis reumatoide u osteoporosis.

25. La composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de una enfermedad proliferativa o una enfermedad asociada con una actividad aumentada de osteoclastos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 22 a

24 en la que la composición farmacéutica es administrada por vía sistémica.

26. La composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de una enfermedad proliferativa o una enfermedad asociada con una actividad aumentada de osteoclastos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 25, en la que adicionalmente es administrado un profármaco a dicho organismo o célula huésped.

27. La composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de una enfermedad proliferativa o una enfermedad 2 asociada con una actividad aumentada de osteoclastos de acuerdo con la reivindicación 26, en la que la

administración de dicho profármaco tiene lugar al menos 3 días, preferentemente al menos 4 días y más preferentemente al menos 5 días después de la administración de dicho poxvirus o composición.

28. La composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de una enfermedad proliferativa o una enfermedad asociada con una actividad aumentada de osteoclastos de acuerdo con la reivindicación 27 en la que la

administración de dicho profármaco tiene lugar 7 días después de la administración de dicho poxvirus o composición.