PÉPTIDOS DERIVADOS DEL RECEPTOR CD4 Y SU PROCEDIMIENTO DE PREPARACIÓN.

Péptidos derivados del receptor CD4 y su procedimiento de preparación. La presente invención tiene por objeto un péptido activado derivado del receptor de CD4, que es capaz de acoplarse mediante enlace covalente a una molécula orgánica y permite así generar múltiples derivados potencialmente antivíricos. Otro objeto es una molécula conjugada que comprende el péptido derivado del receptor CD4 y una molécula orgánica, preferentemente el péptido GPR1 o un polianión. Dicha molécula conjugada puede en particular ser utilizada en los tratamientos antivíricos, en particular el tratamiento del sida. La invención tiene asimismo por objeto los procedimientos de preparación del péptido activado derivado del receptor CD4 y de la molécula conjugada. Las triterapias, que asocian unos inhibidores nucleosídicos (INTI), no nucleosídicos (INNTI) y/o antiproteasas (IP), permiten una reducción de la carga vírica por debajo de los límites de detectabilidad en un gran número de pacientes seropositivos con VIH. Esta eficacia ha permitido una disminución muy notable de mortalidad relacionada con la infección con VIH. Desafortunadamente, unos genotipos que indican una resistencia a un antivírico han sido encontrados en 80% de los pacientes y, de manera más preocupante, 45,5% de las poblaciones víricas son resistentes a una asociación 1NTI/IP y 26% a una asociación de tres clases de anti-VIH (Tamalet et al., AIDS. 7 de nov. de 2003; 17(16):2383-8). Esta constatación es particularmente preocupante cuando se observan unos efectos secundarios relacionados con una toma a largo plazo de triterapias (lipoatrofias, lipodistrofias, hipertriglicidemia, hipercolesterolemia, neuropatías, etc.) observados en 70% de los pacientes bajo tratamiento, que provocan unos malos respetos y paradas "salvajes" frecuentemente origen de la aparición de resistencias. La puesta a punto de tratamientos menos exigentes, que provocan menos efectos secundarios y que no presentan ningún perfil de resistencias cruzadas sigue siendo por lo tanto una prioridad, a pesar del gran número de medicamentos comercializados actualmente. Con este objetivo, es indispensable tener por diana otras etapas del ciclo replicativo del VIH que la retrotranscripción y la proteolisis. El descubrimiento de los correceptores CXCR4 y CCR5 (Broder CC & Collman RG, J Leukoc Biol. jul. de 1997;62(1): 20-9. Review) ha abierto la vía a la comprensión de los mecanismos de infección de una célula hospedante. La primera etapa implica una unión del VIH a la superficie celular, gracias a una interacción entre la glicoproteína gp120 del VIH y el receptor CD4 de la célula diana. Le sigue un cambio conformacional de la gp120 que expondrá un epítopo, denominado CD4i (por CD4 inducido) antes marcado, que constituye una parte del sitio de unión a los correceptores. La interacción gp120/correceptor provocará un nuevo cambio conformacional que permite la exposición de la gp41, lo cual inicia el proceso de fusión de las membranas. La comprensión de este mecanismo ha permitido la puesta a punto de nuevos tipos de medicamentos que inhiben la interacción gp120/CD4 (Bristol-Myers Squibb BMS-488043 en fase clínica IIa), o bien la interacción gp120/CCR5 (Schering-Plough SCH-D y Pfizer UK-427.657 en fase III en 2004-05, y GlaxoSmithKline GSK GW873140/AK602 en fase I), o bien la fase de fusión uniéndose a la gp41 (T20, Fuzéon ® , Roche). Estos resultados extremadamente positivos atestan que los enfoques que tienen como objetivo bloquear una de las etapas de penetración del VIH en una célula son pertinentes. Sin embargo, se puede observar que entre los inhibidores de la interacción gpl20/correceptor en desarrollo clínico, sólo se han estudiado unos productos que inhiben la interacción con CCR5. Los compuestos que se unen a CXCR4 han visto su desarrollo parado, tal como el AMD8664 que provoca unos efectos secundarios a nivel cardiovascular relacionados con su modo de acción (Gao Z & Metz WA, sep. de 2003;103(9):3733-52). La ausencia de tratamiento que inhibe la interacción gp120/CXCR4 podría llevar a término el fracaso de los que tienen como objetivo CCR5, provocando una evolución de la población vírica hacia un tropismo X4 (VIH que infecta a través de CXCR4), frecuentemente asociada a una aceleración de la depleción en linfocitos T CD4+. Curiosamente, el sitio de unión a los correceptores, altamente conservado en el VIH­ 1, el VIH-2 y el SIV (Rizzuto CD et al., 19 de junio de 1998 19;280(5371):1949-53; Kwong PD et al., Nature. 18 de junio de 1998; 393(6686):648-59) no parece ser una diana terapéutica sobre la cual se llevan a cabo muchas investigaciones. El hecho de que este sitio esté oculto, mientras la gp120 no está unida a CD4, hace en efecto el acceso de moléculas a este sitio difícil. La presente invención propone resolver este problema preparando, mediante síntesis química, unos compuestos capaces de unirse al sitio conservado de unión a los correceptores así como al bucle V3. Dichos compuestos serían a priori capaces de inhibir la interacción gp120/CD4 y la interacción gp120/correceptor, sea cual sea el tipo de cepa de VIH. Se conoce desde hace muchos años que ciertos polianiones tales como la heparina (HP) o el sulfato de dextrano (DS), pero no el condroitina sulfato (CS), son capaces de inhibir la infección de células por el VIH (Esté JA, et al., Mol Pharmacol. julio de 1997; 52(1):98-104). Sin embargo, no se utilizan en clínica en particular debido a sus efectos anticoagulantes (Flexner C et al., Antimicrob Agents Chemother. dic. de 1991; 35(12):2544-50). Recientemente, se ha demostrado que el mecanismo molecular de esta inhibición estaba relacionado con una interacción del polianión con el bucle V3 (Moulard M et al., J Virol. feb. de 2000; 74(4):1948-60. Por otra parte, diferentes estudios han explorado la utilización de CD4 soluble para inhibir la interacción del virus con el CD4 expresado en la superficie de las células dianas del VIH. Esta solución resultó ineficaz debido a que cuando se fija a los virus, el CD4 soluble expone el epítopo CD4i, y favorece realmente la interacción del virus con el 2 correceptor CCR5 o CXCR4, lo cual en ciertos casos aumenta la infección (Schenten D. et al, 1999, J Virol. 73: 5373-80). Se conoce a partir de la solicitud de patente internacional publicada con el número WO 03/089000 que un péptido derivado del receptor CD4, cuando se pone en presencia de un polianión, posee una acción anti-VIH. Se preconiza en particular que unos compuestos en los que el péptido y el polianión están unidos se pueden preparar según la descripción realizada en el artículo Najjam S. et al. (Cytokine 1997, 9(12): 1013-1022) (véase el punto 1.1 de la parte ejemplos). En la presente invención, los inventores han obtenido unos péptidos activados derivados del receptor CD4, susceptibles de unir directamente y de manera covalente el polianión o cualquier otra molécula orgánica susceptible de desempeñar un papel en la acción anti-VIH con el miniCD4. Esta activación requiere la introducción previa de residuos de aminoácidos particulares en el péptido nativo. En particular, los inventores han descubierto que la presencia de un receptor de aminoácido lisina, y sólo uno, en la secuencia del péptido derivado del receptor CD4 es indispensable para obtener un péptido activado según la invención. Además, este único residuo de aminoácido lisina debe estar en una posición bien definida en la secuencia del péptido derivado del receptor CD4. La concepción del péptido miniCD4 que comprende un solo residuo de aminoácido lisina en posición definida permite introducir selectiva y directamente cualquier función sobre el miniCD4. La presente invención ofrece así unos compuestos activados que permiten generar múltiples derivados potencialmente antivíricos. Estos derivados consisten en unas moléculas conjugadas que comprenden un péptido CD4 acoplado de manera específica a una molécula orgánica, tal como un polianión, o por medio de un brazo espaciador. Este enfoque es ventajoso desde el punto de vista terapéutico para inhibir la unión del virus sobre las células, debido a que tiene como diana directamente el virus y no las células en sí. Por lo tanto, en primer lugar, está desprovista de los efectos celulares que se observan con los medicamentos que se unen a los correceptores. Por otra parte, a la vista de la conservación de los sitios implicados en función de los diferentes tropismos víricos, los compuestos según la invención deberían interactuar con los gp120 de diferentes aislados víricos. Además, incluso si es ilusorio pensar que no aparecerán unas resistencias, este nuevo tipo de compuesto sólo debería provocar difícilmente su aparición. En efecto, el sitio CD4 de gp120 debe permanecer íntegro para continuar uniéndose a CD4 y los residuos básicos implicados... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de preparación de un péptido activado derivado del receptor CD4, siendo dicho péptido, una vez activado, capaz de acoplarse mediante enlace covalente a una molécula orgánica, y en el que dicho péptido derivado del receptor CD4 comprende la secuencia general (I) siguiente: en la que: ES 2 367 400 T3 Xaa f - P1-Lys- Cys - P2 - Cys - P3-Cys- Xaa g -Xaa h -Xaa i -Xaa j -Cys-Xaa k -Cys-Xaa l -Xaa m , (I) - P1 representa 3 a 6 residuos de aminoácidos, - P2 representa 2 a 4 residuos de aminoácidos, - P3 representa 6 a 10 residuos de aminoácidos, - Xaa f representa la N-acetilcisteína (Ac-Cys) o el ácido tiopropiónico (TPA), - Xaa g representa Ala o Gln, - Xaa h representa Gly o (D)Asp o Ser, - Xaa i representa Ser o His o Asn, - Xaa j representa la bifenilalanina (Bip), la fenilalanina o la [beta]-naftilalanina, - Xaa k representa Thr o Ala, y - Xaa l representa Gly, Val o leu, - Xaa m representa -NH2 o -OH, siendo los residuos de aminoácidos en P1, P2 y P3 naturales o no naturales, idénticos o diferentes, siendo dichos residuos de P1, P2 y P3 todos diferentes del residuo Lys, y teniendo o no P1, P2 y P3 una secuencia común, caracterizado porque el procedimiento comprende la puesta en presencia del péptido de secuencia general (I) derivado del receptor CD4 con un compuesto bifuncional que contiene dos grupos activos, de los que por lo menos uno de los dos grupos activos es capaz de formar un enlace covalente con la función amina libre (-NH2) del residuo de aminoácido Lys presente en la secuencia general (I). 2. Procedimiento de preparación de un péptido activado según la reivindicación 1, en el que la secuencia del péptido derivado del receptor CD4 de secuencia general (I) se selecciona de entre el grupo constituido por las secuencias SEC ID nº 1 y SEC ID nº 2. 3. Procedimiento de preparación de un péptido activado según la reivindicación 1 ó 2, en el que el grupo activo capaz de formar un enlace covalente con la función amina libre (-NH2) del residuo de aminoácido Lys presente en la secuencia general (I) es el grupo activo éster N-hidroxisuccinimida (NHS). 4. Procedimiento de preparación de un péptido activado según la reivindicación 3, en el que los dos grupos activos del compuesto bifuncional son diferentes, y en el que uno de los dos grupos representa el grupo activo NHS. 5. Procedimiento de preparación de un péptido activado según la reivindicación 4, en el que el compuesto bifuncional es el succinimidil-6-[beta-maleimidopropionamido]hexanoato (SMPH). 6. Procedimiento de preparación de un péptido activado según la reivindicación 4, en el que el compuesto bifuncional se selecciona de entre el grupo constituido por el N-succinimidol-S-acetiltioacetato (SATA) y el N-succinimidil-S-acetiltiopropionato (SATP). 7. Procedimiento de preparación de un péptido activado según la reivindicación 4, en el que el compuesto bifuncional es NHS-PEOn-maleimida, estando n comprendido entre 2 y 24. 8. Procedimiento de preparación de un péptido activado según la reivindicación 2, en el que n = 2, siendo el compuesto bifuncional el éster de succinimidil-[(N-maleimidopropionamido)-dietilenglicol]. 9. Procedimiento de preparación de un péptido activado según una de las reivindicaciones 1 a 8, en el que Xaa f representa TPA, que comprende una etapa previa de preparación del péptido derivado del receptor CD4 de secuencia general (I), en la que el péptido derivado del receptor CD4 de secuencia general (II) siguiente: P1 - Lys - Cys - P2 - Cys - P3 - Cys - Xaa g - Xaa h - Xaa i - Xaa j - Cys - Xaa k -Cys-Xaa l -Xaa m , (II) en la que P1 a P3 y Xaa g a Xaa m son tal como se han definido en la secuencia general (I), se pone en presencia con el 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo (SPDP) para incorporar el TPA en el extremo N-terminal de dicho péptido derivado del receptor CD4 de secuencia general (II). 10. Péptido activado derivado del receptor CD4 que comprende la secuencia general (I) tal como se ha definido en la 19 reivindicación 1, en el que el residuo de aminoácido Lys está unido de manera colvalente, ventajosamente por una unión amina, a un grupo activo capaz de unirse mediante enlace covalente a una molécula orgánica. 11. Péptido activado según la reivindicación 10, en el que el grupo activo es el grupo maleimida. 12. Péptido activado según la reivindicación 11, de estructura molecular siguiente: 10 13. Péptido activado según la reivindicación 11, de estructura molecular siguiente: 14. Péptido activado según la reivindicación 10, en el que el grupo activo es el grupo tioacetilo. 15. Péptido activado según la reivindicación 14, de estructura molecular siguiente: 20 16. Péptido activado según la reivindicación 14, de estructura molecular siguiente: 17. Procedimiento de preparación de una molécula conjugada que comprende un péptido derivado del receptor CD4 25 acoplado mediante enlace covalente a una molécula orgánica, comprendiendo dicho péptido derivado del receptor CD4 la secuencia general (I) tal como se ha definido en la reivindicación 1, caracterizado porque el procedimiento comprende la puesta en presencia del péptido activado según una de las reivindicaciones 10 a 16, con la molécula orgánica. 30 18. Procedimiento de preparación de una molécula conjugada según la reivindicación 17, en el que el péptido activado es el péptido según una de las reivindicaciones 11 a 13, y la molécula orgánica contiene una función tiol o tioacetilo. 19. Procedimiento de preparación de una molécula conjugada según la reivindicación 18, en el que la molécula 35 orgánica que contiene una función tiol es el péptido GPR1 de secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las secuencias SEC ID nº 3 y SEC ID nº 4. 20 Procedimiento de preparación de una molécula conjugada según la reivindicación 18, en el que la molécula orgánica que contiene una función tiol se selecciona de entre el grupo constituido por los péptidos que comprenden 40 esencialmente unos residuos ácidos, comprendiendo los péptidos esencialmente unos residuos fosforilables, y comprendiendo los péptidos esencialmente unos residuos sulfatables. ES 2 367 400 T3 21. Procedimiento de preparación de una molécula conjugada según la reivindicación 18, en el que la molécula orgánica que contiene una función tiol es un polianión modificado que contiene la función tiol. 22. Procedimiento de preparación de una molécula conjugada según la reivindicación 21, en el que el polianión modificado que contiene la función tiol se selecciona de entre el grupo constituido por la heparina y el sulfato de heparano, y tiene un grado de polimerización dp de 10 a 24. ES 2 367 400 T3 23. Procedimiento de preparación de una molécula conjugada según la reivindicación 17, en el que el péptido activado es el péptido según una de las reivindicaciones 14 a 16, y la molécula orgánica contiene una función maleimida o halógeno. 24. Molécula conjugada que comprende un péptido derivado del receptor CD4 que comprende la secuencia general (I) tal como se ha definido en la reivindicación 1, acoplado a una molécula orgánica, en la que el péptido derivado del receptor CD4 y la molécula orgánica están acoplados entre sí mediante un brazo espaciador, y en la que el residuo de aminoácido Lys de la secuencia general (I) forma una unión amina con el brazo espaciador. 25. Molécula conjugada según la reivindicación 24, en la que la secuencia general (I) es la secuencia SEC ID nº 1, y la molécula orgánica que contiene una función tiol es el péptido GPR1 de secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por las secuencias SEC ID nº 3 y SEC ID nº 4. 26. Molécula conjugada según la reivindicación 24, en la que la secuencia general (I) es la secuencia SEC ID nº 1, y la molécula orgánica que contiene una función tiol es el polianión modificado que contiene la función tiol. 27. Utilización del péptido activado según una de las reivindicaciones 11 a 13, para el acoplamiento de una molécula orgánica que comprende una función tiol o tioacetilo. 28. Utilización del péptido activado según una de las reivindicaciones 14 a 16, para el acoplamiento de una molécula orgánica que comprende una función maleimida o halógeno. 29. Utilización del péptido activado según una de las reivindicaciones 10 a 16, para la preparación de un medicamento destinado a un tratamiento antivírico. 30. Utilización según la reivindicación 29, en la que el medicamento está destinado a tratar el sida. 31. Molécula conjugada según la reivindicación 25 ó 26, para su utilización como medicamento. 32. Utilización de la molécula conjugada según la reivindicación 25 ó 26, para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento del sida. 21 ES 2 367 400 T3 22 ES 2 367 400 T3 23 ES 2 367 400 T3 24 ES 2 367 400 T3 ES 2 367 400 T3 26 ES 2 367 400 T3 27 ES 2 367 400 T3 28 ES 2 367 400 T3 29 ES 2 367 400 T3 ES 2 367 400 T3 31 ES 2 367 400 T3 32