La presente invención pertenece al grupo de las herramientas de control de contaminación fecal en agua y alimentos.

Especialmente, la presente invención se refiere a una pareja de oligonucleótidos sintéticos cebadores para la amplificación genética del gen lacZ así como a un método cuantitativo para la detección de enterobacterias en productos lácteos

Oligonucleótidos sintéticos para la detección de enterobacterias lactosa positivo.

Campo de la invención

La presente invención se encuadra en el campo de las herramientas de control de contaminación fecal en agua y alimentos. Especialmente, la presente invención se refiere a una pareja de oligonucleótidos sintéticos para la amplificación genética, así como a un método cuantitativo para la detección de enterobacterias en productos lácteos.

Antecedentes de la invención.

Las enterobacterias lactosa positivo son indicadoras de contaminación fecal en agua y alimentos. La familia Enterobacteriaceae comprende bacterias Gram-negativas, aerobias o anaerobias facultativas, capaces de fermentar la lactosa en 48 horas con producción de gas y ácido, en medios de cultivo sólidos o líquidos. Los géneros que integran este grupo son Escherichia, Enterobacter, Citrobacter y Klebsiella. E. coli es huésped normal del tracto intestinal del hombre y los animales de sangre caliente, por lo cual se encuentra en grandes cantidades en las heces y el estiércol. La detección de E. coli es particularmente importante en el análisis de aquellos alimentos compuestos en los que el tratamiento de cada una de las partes haya sido diferente, por ejemplo que contenga un componente pasteurizado y otro no pasteurizado. El microorganismo En. aerogenes se presenta en las heces, aunque puede también provenir del suelo y materia vegetal en descomposición.

Los tratamientos térmicos o de clorado eliminan fácilmente ambos microorganismos de las aguas y los alimentos. La pasteurización se utiliza sistemáticamente en la industria láctica ya que destruye efectivamente las enterobacterias presentes en la leche y sus derivados. Por ello, la presencia de altos valores de enterobacterias lactosa positivo en los alimentos lácteos es síntoma de fallos en el proceso de elaboración o de conservación que pueden acarrear riesgos para el consumidor.

Sin embargo, la industria láctea utiliza métodos poco específicos para detectar enterobacterias lactosa positivo debido a que todos los procedimientos existentes en el campo de la técnica para su recuento específico requieren el cultivo de estos microorganismos, lo cual puede llevar varios días y por lo tanto no permite la rápida comercialización de productos frescos. Además, muchos de estos microorganismos no crecen adecuadamente en medios selectivos por lo que se originan falsos negativos que pueden llegar a dañar la salud de los consumidores. Los procedimientos mencionados anteriormente constan de etapas sucesivas, son lentos y de elevado coste. El más común de ellos es la detección de microorganismos capaces de fermentar lactosa a 42º en presencia de un 2% de bilis y de cristal violeta. En alimentos tratados también se puede comprobar la presencia de enterobacterias lactosa positivo mediante la producción de gas en verde brillante con 2% de lactosa.

Como alternativa a estos procedimientos, se han propuesto métodos basados en técnicas de biología molecular, que permiten una detección rápida y específica sin necesidad de un paso de cultivo bacteriano. La técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ha sido aplicada utilizando secuencias que codifican para el gen lacZ (β-galactosidasa) o el gen uidA (β-glucuronidasa) que detectan enterobacterias lactosa positivo totales y E. coli, respectivamente. Sin embargo, seria deseable disponer de un método cuantitativo para determinar un limite máximo de su presencia en alimentos aceptable desde el punto de vista de la salud pública. La PCR cuantitativa en tiempo real (QRT-PCR) permite la detección específica y la cuantificación de microorganismos en una muestra mediante la monitorización continua de la reacción en cadena de la polimerasa. La dificultad para la aplicación efectiva de esta tecnología en la detección de contaminación fecal de aguas y alimentos, radica en encontrar una seña de identidad para el grupo. Un elemento genético en común a todos las enterobacterias lactosa positivo es el gen lacZ. Sin embargo, la variabilidad genética entre especies dificulta el diseño de oligonucleótidos cebadores aptos para la detección de todas las especies comprendidas en el grupo. Karns et al., utilizaron en un método de QRT-PCR, los oligonucleótidos JKP41, JKP42 y JKTM43, que se corresponden con áreas conservadas del gen lacZ de E. coli. Estos oligonucleótidos demostraron ser eficaces en la detección de solo algunas enterobacterias lactosa positivo. Sin embargo, otras bacterias del grupo, de importancia para la salud pública, como por ejemplo Enterobacter cloacae, no pueden ser detectados utilizando los cebadores del gen lacZ ya conocidos en el campo de la técnica.

Así pues, se hace evidente la necesidad de un método de detección de enterobacterias lactosa positivo de amplio espectro y alta especificidad para su aplicación en el control de calidad de las aguas y los productos lácteos y, en general, para su utilización sistemática en la protección de la salud pública.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Comparación de las secuencias nucleotídicas de una región del gen lacZ, en los siguientes microorganismos: E. coli W3110 (número de acceso Genbank AC_000091), E. coli MG1655 (número de acceso Genbank U00096), E. coli 0157:H7 EDL933 (número de acceso Genbank NC_002655), E. coli 0157:H7 str. Sakai (número de acceso Genbank NC_002695), C. freundii MF466 (número de acceso Genbank AY746954), C. freundii OS60 (número de acceso Genbank AY746953), E. cloaceae 10.8-42 (número de acceso Genbank AY746948), E. cloaceae E482 (número de acceso Genbank AY746947), E. cloaceae B5 (número de acceso Genbank DQ266449) E. cloaceae (número de acceso Genbank D42077) y K. pneumoniae (número de acceso Genbank M11441). Los oligonucleótidos de la presente invención se diseñaron según la región sombreada.

Figura 2. Relación entre el ciclo umbral (Ct) y el número células de C. freundii CECT401.

Figura 3. Relación entre el ciclo umbral (Ct) y el número de células de E. coli CECT515.

Figura 4. Relación entre el ciclo umbral (Ct) y el número de células de En. cloacae CECT194.

Figura 5. Relación entre el ciclo umbral (Ct) y el número de células de K. oxytoca CECT143.

Descripción detallada de la invención

Un objeto de la presente invención son unos nuevos oligonucleótidos sintéticos cebadores para detectar y cuantificar de forma específica microorganismos pertenecientes al grupo de las enterobacterias lactosa positivo mediante la técnica de la PCR cuantitativa en tiempo real.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "oligonucleótido sintético" comprende los polímeros sintetizados químicamente de 12 a 50, preferentemente de aproximadamente 15 a aproximadamente 30, y más preferentemente, alrededor de 20 monómeros de desoxirribonucleótido conectados conjuntamente o enlazados mediante enlaces internucleótido 5' a 3'. Los oligonucleótidos sintéticos de la presente invención se utilizan como cebadores en una QRT-PCR. En el contexto de la presente invención un cebador es una molécula nucleotídica sintética, o un fragmento de la misma, que se une en forma complementaria específica a una cadena única de ácido nucleico y es capaz de iniciar la síntesis de dicha cadena por acción de la ADN polimerasa en una mezcla de reacción que contiene además desoxinucleótidos (dNTP), ATP, Mg⁺ y agua. Las expresiones "oligonucleótido sintético de la invención" y "Cebadores de la invención" son equivalentes y se utilizan indistintamente en el contexto de la presente invención.

La comparación de las secuencias nucleotídicas del gen lacZ procedente de distintas especies de enterobacterias lactosa positivo ha permitido la identificación de una región de este gen altamente conservada entre distintas especies de enterobacterias lactosa positivo. Entre estos microorganismos se encuentran E. coli W3110 (número de acceso Genbank AC_000091), E. coli MG1655 (número de acceso Genbank U00096), E. coli 0157:H7 EDL933 (número de acceso Genbank NC_002655), E. coli 0157:H7 str. Sakai (número de acceso Genbank NC_002695), C. freundii MF466 (número de acceso Genbank AY746954), C. freundii OS60 (número de acceso Genbank AY746953), E. cloacae 10.8-42...

1. Oligonucleótidos sintéticos para la detección de enterobacterias lactosa positivo caracterizados por las secuencias nucleotídicas SEQ ID NO 1 y SEQ ID NO 2.

2. Uso de los oligonucleótidos de la reivindicación 1 como cebadores en un método de amplificación nucleica.

3. Uso según la reivindicación 2 donde dicho método es una PCR cuantitativa.

4. Método para la detección de enterobacterias lactosa positivo en un alimento que comprende los pasos de: