NUEVAS CELULASAS ALCALINAS.

Endoglucanasa que es derivable de una cepa de Humicola insolens,

donde dicha endoglucanas comprende 402 residuos de aminoácidos como se relaciona en la Figura 3 y opcionalmente un enlace C-terminal que consiste en 10 aminoácidos como mucho, o una variante de dicha endoglucanasa teniendo una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95% idéntica a dicha secuencia relacionada en la Figura 3 y donde dicha variante tiene uno o más de los siguientes residuos de aminoácidos sustituidos: N89Q; N89Q+N247Q; H123N; T385N; Q399N; E202A; S37W+P39W; M142E; K217A; K218T; K217A+K218T, R245G; I310D; E150Q; E334K; M198L

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E05109384.

Solicitante: NOVOZYMES A/S.

Nacionalidad solicitante: Dinamarca.

Dirección: KROGSHOJVEJ 36 2880 BAGSVAERD DINAMARCA.

Inventor/es: SCHULEIN, MARTIN, ROSHOLM, PETER, NIELSEN, JACK BECH, HANSEN, SVEND AAGE, Osten,Claus von der.

Fecha de Publicación: .

Fecha Solicitud PCT: 8 de Marzo de 1995.

Clasificación PCT:

  • C11D3/386 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C11 ACEITES, GRASAS, MATERIAS GRASAS O CERAS ANIMALES O VEGETALES; SUS ACIDOS GRASOS; DETERGENTES; VELAS.C11D COMPOSICIONES DETERGENTES; UTILIZACION DE UNA SOLA SUSTANCIA COMO DETERGENTE; JABON O SU FABRICACION; JABONES DE RESINA; RECUPERACION DE LA GLICERINA.C11D 3/00 Otros compuestos que entran en las composiciones detergentes cubiertas por C11D 1/00. › Preparaciones que contienen enzimas.
  • C12N9/42 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › actúan sobre los enlaces beta-glucosídicos-1,4, p. ej. celulasa.
  • C12S11/00
  • D06M16/00 SECCION D — TEXTILES; PAPEL.D06 TRATAMIENTO DE TEXTILES O SIMILARES; LAVANDERIA; MATERIALES FLEXIBLES NO PREVISTOS EN OTRO LUGAR.D06M TRATAMIENTO, NO PREVISTO EN OTRO LUGAR EN LA CLASE D06, DE FIBRAS, HILOS, HILADOS, TEJIDOS, PLUMAS O ARTICULOS FIBROSOS HECHOS DE ESTAS MATERIAS (tratamiento de textiles por medios mecánicos, D06B - D06J). › Tratamiento bioquímico de las fibras, hilos, hilados, tejidos o artículos fibrosos hechos de estas materias, p. ej. enzimático.
  • D06P5/02 D06 […] › D06P TEÑIDO O IMPRESION DE TEXTILES; TEÑIDO DE CUERO, DE PIELES O DE SUSTANCIAS MACROMOLECULARES SOLIDAS DE CUALQUIER FORMA (para la parte mecánica D06B, D06C; tratamiento de la superficie de fibras filamentos de vidrio, sustancias minerales o escorias C03C 25/00). › D06P 5/00 Otras características del teñido o de la impresión de textiles o del teñido del cuero, de pieles o de sustancias macromoleculares de todas formas. › Post-tratamiento.
  • D06P5/13 D06P 5/00 […] › Coloración fugitiva o desarme de los colorantes.
  • D06P5/15 D06P 5/00 […] › Descarga local de colorantes.
  • D21C5/00 D […] › D21 FABRICACION DEL PAPEL; PRODUCCION DE LA CELULOSA.D21C PRODUCCION DE CELULOSA POR ELIMINACION DE SUSTANCIAS NO CELULOSICAS DE LAS MATERIAS QUE CONTIENEN LA CELULOSA; REGENERACION DE LIQUIDOS RESIDUALES; APARATOS PARA ESTE EFECTO.Otros procedimientos para obtener la celulosa, p. ej. cocción de borra de algodón.
  • D21H17/00 D21 […] › D21H COMPOSICIONES DE PASTA; SU PREPARACION NO CUBIERTA POR LAS SUBCLASES D21C, D21D; IMPREGNACION O REVESTIMIENTO DEL PAPEL; TRATAMIENTO DEL PAPEL TERMINADO NO CUBIERTO POR LA CLASE B31 O LA SUBCLASE D21G; PAPEL NO PREVISTO EN OTRO LUGAR.Materiales no fibrosos añadidos a la parte caracterizados por su constitución; Materiales de impregnación del papel caracterizados por su constitución.
  • D21H21/10 D21H […] › D21H 21/00 Materiales no fibrosos añadidos a la pasta, caracterizados por su función, su forma o sus propiedades; Materiales de impregnación o de revestimiento del papel, caracterizados por su función, su forma o sus propiedades. › Agentes de retención o productos que mejoran el drenaje.

Clasificación antigua:

  • C11D3/386 C11D 3/00 […] › Preparaciones que contienen enzimas.
  • C12N9/42 C12N 9/00 […] › actúan sobre los enlaces beta-glucosídicos-1,4, p. ej. celulasa.
  • C12S11/00
  • D06M16/00 D06M […] › Tratamiento bioquímico de las fibras, hilos, hilados, tejidos o artículos fibrosos hechos de estas materias, p. ej. enzimático.
  • D06P5/02 D06P 5/00 […] › Post-tratamiento.
  • D06P5/13 D06P 5/00 […] › Coloración fugitiva o desarme de los colorantes.
  • D06P5/15 D06P 5/00 […] › Descarga local de colorantes.
  • D21C5/00 D21C […] › Otros procedimientos para obtener la celulosa, p. ej. cocción de borra de algodón.
  • D21H17/00 D21H […] › Materiales no fibrosos añadidos a la parte caracterizados por su constitución; Materiales de impregnación del papel caracterizados por su constitución.
  • D21H21/10 D21H 21/00 […] › Agentes de retención o productos que mejoran el drenaje.

Países PCT: Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Italia, Países Bajos.

PDF original: ES-2360529_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Nuevas celulasas alcalinas.

La presente invención se refiere a una celulasa capaz de eliminar suciedad de tejido, una composición detergente que comprende la celulasa, un método de tratamiento de tejido manchado con la enzima celulolítica, y uso de la celulasa p. ej. en composiciones detergentes, en suavizantes de tejido, para la clarificación de color de tejidos textiles (eliminación de pelusas y bolitas), para evitar la redeposición en el lavado del tejido, para eliminar la suciedad, para el desentintado de papel usado, y para reciclar pasta de papel.

Antecedentes de la invención

El lavado repetido de los tejidos, especialmente tejidos que contienen celulosa, suelen causar una aspereza en el tejido usado. El uso de celulasas, es decir enzimas celulolíticas, para la reducción de la aspereza de los tejidos que contienen celulosa, p. ej. algodón, fue sugerido y demostrado hace mucho tiempo.

La explotación práctica de las celulasas ha sido, hasta cierto punto, atrasada por la naturaleza de las preparaciones con celulasa conocidas que suelen ser mezclas complejas de una variedad de componentes individuales de celulasa, y que pueden tener una actividad específica más bien baja. Es difícil optimizar la producción de componentes individuales en múltiples sistemas enzimáticos y así llevar a cabo una producción industrial de celulasas con buena relación entre coste y eficacia, y su uso real ha sido impedido por las dificultades que surgen de la necesidad de emplear cantidades más bien grandes de enzimas para conseguir el efecto deseado.

Los inconvenientes de las celulasas previamente sugeridas pueden ser remediados usando enzimas monocomponentes seleccionadas por una alta actividad específica. Las celulasas monocomponentes están descritas en, p. ej. WO 91/17243, WO 91/17244 y WO 91/10732.

P. ej. en WO 91/17244 se describe una enzima de degradación de celulosa (una celulasa) derivable de un hongo distinto a Trichoderma o Phanerochaete que comprende un dominio de enlace de carbohidrato homólogo a una región A-terminal de celulasas de Trichoderma reesei, el dominio de enlace de carbohidrato siendo capaz de efectuar el enlace de la enzima a un sustrato celulósico insoluble, que puede ser empleado para el tratamiento textil, p. ej. para reducir la aspereza de tejidos que contienen algodón y para eliminar la suciedad y clarificar el color de tejidos. En el ejemplo 3 y fig. 13 se describe la preparación de una endoglucanasa de la familia C de Fusarium oxysporum y la secuencia de ADN y secuencia de aminoácidos derivada, respectivamente. Más tarde se descubrió que la secuencia de aminoácidos descrita no era correcta; la secuencia correcta está publicada en Sheppard, P.O., Grant, F.J., Oort, P.J., Sprecher, C.A., Foster, D.C., Hagen, F.S., Upshall, A., Mcknight, G.L. y Ohara, P.J.: Uso de secuencias específicas de familias de celulasa conservadas para clonar ADNc de homólogos de celulasa de Fusarium oxysporum. Gen. 150:163-167, 1994. En el ejemplo 4 y Fig. 14A-E se describe la preparación de una endoglucanasa I de Humicola insolens (EG I) y la secuencia de ADN y secuencia de aminoácidos derivada, respectivamente. Además, en el ejemplo 4 (página 32, línea 1 a 5) se describe la construcción del plásmido de expresión de una EG I truncada (denominada EG I') donde los últimos 13 aminoácidos de la región de codificación fueron eliminados y se alteró Val a Leu en la posición 421 (posición 401 en la secuencia de la enzima). El quid de la invención descrita en WO 91/17244 es proporcionar una celulasa que, además de la holoenzima, tenga un dominio de enlace de carbohidrato (CBD) que sea homólogo a la región A de las celulasas de Trichoderma reesei, puesto que se pensó que la función del CBD en la molécula de enzima mediaba el enlace a sustratos sólidos incluyendo celulosa y consecuentemente potenciaba la actividad de tales enzimas hacia tales sustratos.

El problema subyacente de la presente invención es obtener endoglucanasas monocomponentes que tengan una actividad enzimática mejorada en un rango de pH alcalino, mientras ejerza a la vez una acción celulolítica moderada en el sustrato celulósico. En otras palabras, la endoglucanasa no debería destruir el sustrato celulósico como tal. Por ejemplo, cuando el sustrato es un tejido celulósico, la endoglucanasa usada no debería suponer una pérdida de fuerza de tracción sustancial del tejido. La actividad alcalina mejorada de la enzima es también esencial, puesto que la mayoría de las aplicaciones de endoglucanasas tienen lugar ventajosamente en un rango de pH alcalino.

Resumen de la invención

Sorprendentemente, se acaba de descubrir que determinadas celulasas que no comprenden un dominio de enlace de carbohidrato, es decir, consisten esencialmente en la holoenzima, o que al menos no comprenden un dominio de enlace de carbohidrato que sea homólogo a la región A de las celulasas de Trichoderma reesei, pueden tener una actividad mejorada. Esto puede por ejemplo suponer una mejor eliminación de suciedad de los tejidos.

Las celulasas de la invención son endoglucanasas según se define en las reivindicaciones. Pueden tener el residuo de aminoácido triptófano (Trp o W) en la posición correspondiente a la posición 55 del marco de homología estructura en la Figura 5.

Más específicamente, se ha descubierto que las celulasas seleccionadas del grupo consistente en celulasas clasificadas en la familia 7 como se describe en Henrissat, B. et al.: Biochem. J. (1993), 293, p. 781-788, y variantes de celulasa derivada de una celulasa madre clasificada en la familia C, comprendiendo un núcleo y opcionalmente un enlace C-terminal consistente en 10 aminoácidos como mucho, puede resultar excelente en detergentes con respecto a la eliminación de suciedad en comparación con las celulasas conocidas.

En un aspecto, la invención se refiere a endoglucanasas que pueden ser truncadas, p. ej. genéticamente truncadas, variantes de endoglucanasas conocidas, y su uso, p. ej. para lavar, limpiar, desentintar y elaborar pasta de papel.

Las endoglucanasas presentes son útiles p. ej. para eliminar la suciedad y pueden así ser aplicadas a composiciones detergentes, aditivos detergentes y/o suavizantes para tejidos.

Otros usos de las presentes endoglucanasas son la clarificación de color de tejidos textiles (eliminación de pelusas y bolitas), prevención de la redeposición en el lavado del tejido, eliminación de suciedad, desentintado de papel usado, y para reciclar pasta de papel.

Descripción detallada de la invención

En la presente descripción y reivindicaciones, el término "celulasa" denota una enzima que hidroliza celulosa. La celulasa puede ser un componente que ocurre en un sistema de celulasa producido por un microorganismo dado, dicho sistema de celulasa comprendiendo principalmente diferentes componentes enzimáticos de celulasa incluyendo aquellos normalmente identificados como p. ej. celobiohidrolasas, exocelobiohidrolasas, endoglucanasas, β-glucosidasas. De forma alternativa, la celulasa puede ser un único componente, es decir un componente esencialmente libre de otros componentes de celulasa que ocurren normalmente en un sistema de celulasa producido por un microorganismo dado, el único componente siendo un componente recombinante, es decir producido por clonación de una secuencia de ADN que codifica el único componente y subsiguiente célula transformada con la secuencia de ADN y expresada en un huésped. El huésped es preferiblemente un huésped heterólogo, aunque el huésped puede ser también, bajo ciertas condiciones, el huésped homólogo.

La celulasa de la invención es una endoglucanasa como se define en las reivindicaciones.

El término "eliminación de suciedad" o "eliminación de partículas de suciedad", como se utiliza aquí, se refiere a una limpieza mejorada de tejidos o prendas que contienen celulosa, p. ej. algodón, contaminados por partículas de tierra o de otra materia insoluble atrapada por microfibrillas extendidas sobre la superficie de la fibra.

En el presente contexto, el término "homólogo" o "secuencia homóloga" se entiende que indica una secuencia de aminoácidos que difiere de aquella de la figura 3 en uno o más residuos de aminoácidos. La secuencia homóloga puede ser una que resulte de la modificación de una secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 3, p. ej. implicando sustitución de uno o más residuos de aminoácidos en uno o más sitios diferentes en la secuencia... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Endoglucanasa que es derivable de una cepa de Humicola insolens, donde dicha endoglucanas comprende 402 residuos de aminoácidos como se relaciona en la Figura 3 y opcionalmente un enlace C-terminal que consiste en 10 aminoácidos como mucho, o una variante de dicha endoglucanasa teniendo una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95% idéntica a dicha secuencia relacionada en la Figura 3 y donde dicha variante tiene uno o más de los siguientes residuos de aminoácidos sustituidos: N89Q; N89Q+N247Q; H123N; T385N; Q399N; E202A; S37W+P39W; M142E; K217A; K218T; K217A+K218T, R245G; I310D; E150Q; E334K; M198L.

2. Endoglucanasa según la reivindicación 1, donde uno o más de los siguientes residuos de aminoácidos dentro de 5 Å de la celobiosa enlazada son sustituidos; R106x; Y145x, S345x, D34x, W51x, S104x, A143x, Y171x, D173x, Q175x, Y177x, W347x, donde x es elegido para modificar la interacción hidrofóbica y/o potencial del enlace de H con el sustrato, y la numeración se refiere a la numeración de la endoglucanasa EG1 de Fusarium oxysporum.

3. Composición detergente que comprende una endoglucanasa según la reivindicación 1 ó 2 y un tensioactivo.

4. Composición detergente según la reivindicación 3, donde la endoglucanasa se deriva de una cepa de Humicola insolens y que tiene la secuencia de aminoácidos relacionada en la Figura 3 y un peso molecular aparente de aproximadamente 50 kD medido en SDS-PAGE.

5. Composición detergente según la reivindicación 3 ó 4, que además comprende una o más de otras enzimas, en particular amilasas, lipasas, proteasas, componentes de celulasa, peroxidasas, y/u oxidasas.

6. Proceso de lavado donde el tejido sucio es tratado con una endoglucanasa según la reivindicación 1 ó 2.

7. Uso de una endoglucanasa según la reivindicación 1 ó 2 en composiciones detergentes o en composiciones de suavizante en una cantidad que es eficaz para la eliminación de suciedad.

8. Uso de una endoglucanasa según la reivindicación 1 ó 2 para la clarificación del color de tejidos textiles (eliminación de pelusas y bolitas).

9. Uso de una endoglucanasa según la reivindicación 1 ó 2 para evitar la redeposición en el lavado de tejido.

10. Uso de una endoglucanasa según la reivindicación 1 ó 2 para la eliminación de la suciedad en tejidos.

11. Uso de una endoglucanasa según la reivindicación 1 ó 2 para el biopulido de tejidos.

12. Uso de una endoglucanasa según la reivindicación 1 ó 2 para el desentintado de papel usado.

13. Uso de una endoglucanasa según la reivindicación 1 ó 2 para mejorar el drenaje de la pasta de papel.

14. Uso de una endoglucanasa según la reivindicación 1 ó 2 para el desfibrado de pasta de papel.

15. Uso de una endoglucanasa según la reivindicación 1 ó 2 para el descortezado para pasta de papel.


 

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