La presente invención se relaciona con un sistema de nanopartículas lipídicas que comprenden un componente lipídico,

un tensioactivo catiónico, un tensioactivo no iónico, un polisacárido y, opcionalmente, un péptido de carga positiva, útil para la liberación de moléculas farmacológicamente activas, y especialmente para transfectar material genético en células y/o tejidos. Asimismo, se dirige a procedimientos para la obtención de nanopartículas, a composiciones farmacéuticas que lo comprenden, así como a su uso en terapia génica

Nanopartículas lipídicas para terapia génica.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un sistema de nanopartículas lipídicas útil para la liberación de moléculas farmacológicamente activas, y especialmente para transfectar material genético en células y/o tejidos, así como a procedimientos para su obtención y composiciones farmacéuticas que lo comprenden.

Antecedentes

En las últimas décadas se han desarrollado una gran variedad de reactivos y técnicas para transferir material genético al interior de las células con el objeto de modular la expresión génica tanto in vitro como in vivo. Los mayores esfuerzos en este campo están enfocados en la búsqueda de sistemas con mayor eficiencia y en nuevas aplicaciones. Estos esfuerzos están permitiendo obtener sofisticados reactivos y tecnologías útiles para la producción de proteínas con aplicaciones clínicas y de investigación, para la adición de marcadores genéticos a una línea celular y para la modificación de la expresión de proteínas de una célula para evaluar el efecto de un gen (sobreexpresión o disminución de la expresión).

La terapia génica constituye una herramienta terapéutica muy prometedora para el tratamiento de una gran variedad de enfermedades hereditarias o adquiridas. Los recientes avances en biología molecular y el conocimiento del genoma humano han permitido disponer de una valiosa información sobre los procesos celulares y la patogenia de muchas enfermedades. En los últimos años se han identificado numerosos genes implicados en procesos patológicos; además, se está investigando mucho con sistemas de expresión de esos genes para ser utilizados con fines terapéuticos. Sin embargo, el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas usando este material biológico depende de la capacidad de manipular la expresión de estos genes en las células adecuadas.

El número de enfermedades que pueden ser potencialmente tratadas mediante terapia génica es muy amplio, y se incluyen, entre otras, enfermedades autosómicas recesivas debidas al defecto de un único gen (fibrosis quística, hemofilia, enfermedad de Fabry, etc.), enfermedades autosómicas dominantes, algunos cánceres, VIH y otras enfermedades infecciosas, enfermedades inflamatorias, etc.

La terapia génica consiste en la introducción de material genético (ADN, ARN o secuencias antisentido) en células diana con el fin de modular la expresión de determinadas proteínas que se encuentran alteradas, revirtiendo así el trastorno biológico que provoca la alteración de las mismas. Se pueden administrar genes desnudos de forma local en determinados órganos como el músculo o el hígado mediante medios físicos, como la electroporación o la inyección hidrodinámica. Sin embargo, estos métodos no son útiles para la administración sistémica o son inviables desde el punto de vista de su comercialización como medicamentos. Para desarrollar un producto para terapia génica hay que tener en cuenta, no sólo la enfermedad que se quiere tratar y el gen terapéutico a administrar, si no que es muy importante el sistema de administración de ese gen. Es necesario que el sistema de administración sea capaz de proteger el material genético frente a la degradación enzimática y que facilite la captación celular y posterior liberación en el citoplasma celular. Además, debe permitir controlar la localización del gen en el organismo así como la duración de la expresión génica. Los sistemas de administración de genes pueden clasificarse en vectores virales o no virales. Los vectores virales son los más efectivos, pero presentan grandes problemas de inmunogenicidad y oncogenicidad. Otro inconveniente es que sólo pueden incluir genes de pequeño tamaño.

Debido a los inconvenientes que presentan estos sistemas de transfección viral, existe una importante necesidad de desarrollar sistemas de transfección no viral con una adecuada eficacia de transfección que supongan una mejor alternativa a la utilización de los vectores virales. Los vectores no virales son, de hecho, mucho más seguros, su producción es más sencilla y más barata y no presentan una limitación en cuanto al tamaño del material genético a incluir. En este sentido, los sistemas basados en nanopartículas han mostrado ser útiles como sistemas de transfección. Así, la solicitud US2008/0160096 describe la obtención de nanopartículas basadas en un policatión complejado con uno o más ácidos nucleicos, estando dicho complejo recubierto con un polianión. Por su parte, la solicitud WO2007/135164 hace referencia a la preparación de nanopartículas basadas en quitosano y hialuronano para la asociación de material genético, habiéndose demostrado su particular utilidad para transfectar tejido ocular.

Existen además en la literatura varios documentos que describen la obtención y empleo de nanopartículas lipídicas como vectores para el transporte de material genético a las células (WO2005/120469, WO2006/087752, WO2004/096140 y US2008/0213350). En particular, el documento de Del Pozo-Rodríguez et al. (J. Control. Rel., 2009, 133, 52-59) hace referencia a un sistema de nanopartículas lipídicas que incorpora además tensioactivos iónicos, donde dichas nanopartículas se ponen en contacto con un complejo constituido por un plásmido y un péptido para recubrir a éstas. Nanopartículas lipídicas en las que también se incorpora un péptido, se encuentran descritas en WO00/06120. Por su parte, la solicitud US2006/0189554 describe una vacuna que incorpora un sistema de nanopartículas lipídicas sobre las que se deposita en su superficie un adyuvante, adsorbiéndose posteriormente un plásmido de ADN. No obstante, la mayoría de estos sistemas presentan como principal desventaja una baja eficacia de transfección.

A la vista de estos datos, existe, por tanto, una necesidad de desarrollar medicamentos para terapia génica basados en vectores no virales seguros y con una adecuada eficacia de transfección.

Breve descripción de la invención

Los autores de la presente invención han encontrado que un sistema de nanopartículas lipídicas que incorpora un polisacárido en su composición, permite conseguir un eficaz nivel de transfección de material genético en las células, así como una elevada viabilidad celular, como así demuestran los ejemplos realizados in vitro en células eucariotas de mamíferos ARPE-19.

Asimismo, estudios in vivo han demostrado la capacidad de este sistema de nanopartículas para alcanzar las células de bazo e hígado, permitiendo la expresión de plásmidos de ADN como pCMS-EGPF de forma efectiva, lo que hace a este sistema ser potencialmente útil en terapia génica.

Este sistema ha sido capaz además de proteger el material genético de la acción de enzimas, en particular, de nucleasas, que están presentes en los fluidos biológicos, lo que evita su degradación o ruptura en este medio biológico, evitando así que el material genético se libere de las nanopartículas antes de alcanzar su objetivo final.

Así, en un primer aspecto la invención se dirige a un sistema para la liberación de moléculas biológicamente activas, que comprende nanopartículas con un tamaño promedio de partícula igual o inferior a 1 micra, donde las nanopartículas comprenden:

- al menos un lípido sólido a temperatura ambiente;

- al menos un tensioactivo catiónico;

- al menos un tensioactivo no iónico; y

- al menos un polisacárido, donde dicho polisacárido comprende la unión de al menos tres monosacáridos, con la condición de que dicho polisacárido no sea un lipopolisacárido, y donde dicho polisacárido se encuentra incorporado dentro de la estructura de las nanopartículas o bien adsorbido sobre la superficie de las mismas.

Por otra parte, se ha observado que la incorporación del polisacárido junto con un péptido de carga positiva, permite aumentar de forma sinérgica los niveles de transfección cuando se compara con un sistema de nanopartículas que incluye únicamente el mencionado péptido o el polisacárido, así como mejorar la viabilidad celular tal como se recoge en los ejemplos aportados en esta solicitud. En consecuencia, un aspecto adicional de la presente invención lo constituye un sistema como el mencionado anteriormente que comprende además un péptido de carga positiva, donde dicho péptido se encuentra incorporado dentro de la estructura de las nanopartículas o bien adsorbido sobre la superficie de las mismas.

En otro aspecto, la invención... [Seguir leyendo]

1. Sistema para la liberación de moléculas biológicamente activas que comprende nanopartículas con un tamaño promedio de partícula igual o inferior a 1 micra, donde 1 as nanopartículas comprenden:

- al menos un lípido sólido a temperatura ambiente;

- al menos un tensioactivo catiónico;

- al menos un tensioactivo no iónico; y

- al menos un polisacárido, donde dicho polisacárido comprende la unión de al menos tres monosacáridos, con la condición de que dicho polisacárido no sea un lipopolisacárido, y donde dicho polisacárido se encuentra incorporado dentro de la estructura de las nanopartículas o bien adsorbido sobre la superficie de las mismas.

2. Sistema según la reivindicación 1, que además comprende al menos un péptido de carga neta positiva.

3. Sistema según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, que además comprende una molécula biológicamente activa.

4. Sistema según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el lípido sólido a temperatura ambiente se selecciona entre monoglicéridos, diacilglicéridos, triacilglicéridos y mezclas de los mismos.

5. Sistema según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el tensioactivo catiónico se selecciona entre sales de amonio primario, secundario, terciario y cuaternario, de estructura lineal o cíclica, mezclas de las mismas y derivados de las mismas.

6. Sistema según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde el tensioactivo no iónico se selecciona entre polisorbatos, copolímeros de polietilenglicol, copolímeros de polipropilen glicol y mezclas de los mismos.

7. Sistema según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde el polisacárido se selecciona entre quitosanos, dextranos, ácido hialurónico, carragenano, condroitina, keratano, ácido colomínico, xantano, ciclodextrinas, sales, derivados y mezclas de los mismos.

8. Sistema según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, donde el péptido de carga neta positiva se selecciona entre péptidos de señalización nuclear, péptidos de señalización mitocondrial, péptidos de reconocimiento de la superficie celular que comprenden la secuencia arginina-glicina-ácido aspártico y péptidos de penetración celular.

9. Sistema según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8, donde la molécula biológicamente activa se selecciona entre ácidos nucleicos, péptidos, proteínas, polisacáridos, lípidos y mezclas de los mismos.

10. Sistema según la reivindicación 9, donde la molécula biológicamente activa se selecciona entre ADN, mARN, iARN, microRNA, oligonucleótidos y secuencia antisentido.

11. Procedimiento para la preparación de un sistema como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-10, que comprende:

donde el polisacárido, y opcionalmente el péptido, pueden formar parte de la disolución (ii) o pueden formar parte de una disolución acuosa que se pone en contacto con las nanopartículas lipídicas previamente formadas tras la consecución de las etapas (i) a (iv).

12. Procedimiento para la preparación de un sistema como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-10, que comprende:

donde el polisacárido, y opcionalmente el péptido, pueden formar parte de la disolución (ii) o pueden formar parte de una disolución acuosa que se pone en contacto con las nanopartículas lipídicas previamente formadas tras la consecución de las etapas (i) a (iv).

13. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 11-12, en el que las nanopartículas lipídicas obtenidas tras la consecución de las etapas i) a iv) se ponen en contacto con una disolución que comprende una molécula biológicamente activa.

14. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 11-12, en el que la molécula biológicamente activa se incorpora en la etapa (i) de preparación de la solución que comprende el lípido o en el lípido fundido, o bien en la etapa (ii) (ii)de preparación de la disolución acuosa que comprende el tensioactivo catiónico y el tensioactivo no iónico.

15. Sistema de nanopartículas obtenible según el procedimiento definido en cualquiera de las reivindicaciones 11-14.

16. Composición farmacéutica o cosmética que comprende el sistema de nanopartículas como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-10 ó 15.

17. Sistema según cualquiera de las reivindicaciones 1-10 ó 15, para su uso como medicamento.

18. Sistema según cualquiera de las reivindicaciones 1-10 ó 15, para su uso en la preparación de un medicamento para terapia génica.