Polipéptido B-Raf humano mutante que se produce de manera natural aislado que comprende una o más mutaciones somáticas de aminoácidos asociadas al cáncer,

en el que las mutaciones de aminoácidos se producen en una o más de las posiciones 463, 465, 468, 585, 594, 595, 596 y 599 en B-Raf que presenta la secuencia:

Campo de la invención

La presente invención se refiere a los mutantes específicos de cáncer de los genes B-raf y a las utilizaciones de los mismos en la detección de células anómalas y de cáncer. Además, la invención describe procedimientos para el diagnóstico del cáncer, la detección de células cancerosas en sujetos y el desarrollo de los agentes terapéuticos para el tratamiento del cáncer.

Introducción

El cáncer puede desarrollarse en cualquier tejido de cualquier órgano a cualquier edad. La mayoría de los cánceres detectados en un estadio precoz son potencialmente curables; por tanto, la capacidad de examinar pacientes para detectar signos precoces de cáncer, y permitir así la intervención temprana, resulta sumamente deseable (véase, por ejemplo, the Merck Manual of Diagnosis and Therapy (1992) 16ª ed., Merck & Co).

Las células cancerosas presentan un crecimiento no regulado, una falta de diferenciación, y una capacidad para invadir tejidos locales y para metastatizar. Por tanto, las células cancerosas son células distintas de las normales, y pueden identificarse potencialmente no sólo por sus rasgos fenotípicos, sino también por sus características bioquímicas y de biología molecular. Tales características son determinadas a su vez por cambios en las células cancerosas que se producen a nivel genético en un subconjunto de genes celulares conocidos como oncogenes, que controlan directa o indirectamente el crecimiento y la diferenciación celular.

La familia de oncogenes Raf incluye tres genes altamente conservados denominados A-, B- y C-raf (también denominados raf-1). C-Raf, el miembro mejor caracterizado de la familia raf, es el homólogo celular de v-raf, el gen transformante del virus del sarcoma murino 3611. El oncogén raf viral codifica para una proteína que carece de las secuencias amino-terminales de la proteína Raf normal. Estas secuencias amino-terminales son cruciales para la regulación de la actividad serina/treonina-proteína cinasa de RAF, y su deleción o sustitución da como resultado la actividad constitutiva de la proteína RAF codificada por el oncogén. Esta actividad no regulada estimula la proliferación celular, lo que da como resultado la transformación celular. Se ha afirmado que el ADN de algunos tumores contiene una actividad transformante detectable mediante la transfección de ADN de las células NIH/3T3, identificadas como derivadas de C-raf-1 truncado. Sin embargo, es probable que estos resultados sean artefactos de la transfección ya que no se han encontrado las mismas mutaciones en los tumores de los que provenía el ADN transformante. Las mutaciones creadas de manera artificial en el gen C-raf, cuando se introducen en las células in vitro pueden inducir transformación.

El gen b-raf es el homólogo humano del protooncogén c-Rmil de aves que codifica una serina/treonina cinasa de 94 kD detectada en células de aves. Esta proteína contienen secuencias amino-terminales no encontradas en otras proteínas de la familia génica mil/raf. Estas secuencias están codificadas por 3 exones en el genoma aviar. Eychene et al. (1992) Oncogene 7: 1657-1660 notificaron que estos 3 exones se conservan en el gen B-raf humano y que codifican para una secuencia de aminoácidos similar a la del gen de aves. Se identificaron 2 loci de B-raf humanos: B-raf 1, que se mapeó en 7q34 mediante hibridación in situ con fluorescencia y que se demostró que codifican para el producto génico funcional, y B-raf 2, un pseudogén procesado inactivo ubicado en Xq13.

Al examinar una biblioteca de ADNc de ratón con una sonda de oncogén v-raf, Huebner et al. (1986) Proc. Nat. Acad. Sci. 83: 3934-3938 aislaron un ADNc relacionado con raf transformante, A-raf, que representó un gen distinto de raf1. El locus de A-raf individual del ratón y el locus de A-raf1 del hombre se transcriben de manera activa en varias líneas celulares de ratón y humanas. La secuencia de 606 aminoácidos completa del oncogén A-raf1 humano se ha deducido a partir de la secuencia de 2.453 nucleótidos del ADNc. El gen A-raf está ligado al cromosoma X.

Un mecanismo conocido para la conversión de protooncogenes en oncogenes es la aparición de mutaciones individuales en la secuencia de ADN, conocidas como mutaciones puntuales, que dan como resultado un cambio en la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado. Por ejemplo, los oncogenes ras no están presentes en las células normales, pero sus homólogos oncogénicos están presentes en todas las células. Las proteínas Ras de tipo natural son proteínas de unión a GTP pequeñas que están implicadas en la traducción de señales. Sin embargo, muchos oncogenes ras de virus y tumores humanos presentan una mutación puntual en el codón número 12: el codón GGC que normalmente codifica para una glicina se cambia por GTC, que codifica para una valina. Se ha informado de múltiples mutaciones en este codón, que incluyen por lo menos 5 sustituciones diferentes que se activan. Este cambio de un solo aminoácido impide la actividad GTPasa de la proteína Ras, y hace que Ras se active constitutivamente, dado que permanece unido a GTP. Los aminoácidos en las posiciones 13 y 61 también se cambian frecuentemente en los oncogenes ras de tumores humanos. La proteína Raf es una serina/treonina cinasa que está relacionada estructuralmente con la familia de la proteína cinasa C (PKC), y es esencial en el crecimiento y la diferenciación celular. Las proteínas Raf están implicadas en la transducción de señales en la activación de MAP cinasa, que está altamente conservada en organismos eucariotas. Las MAP cinasas (proteína cinasas activadas por mitógeno), que incluyen ERK1 y ERK2, fosforilan directamente los factores de trascripción para regular los acontecimientos biológicos. Las MAPKK (MAP cinasa cinasas) y MAPKKK (MAPKK cinasas) regulan a su vez las MAP cinasas.

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La proteínas Raf son MAPKKK y se cree que fosforilan la MAPKK MEK in vivo en sistemas biológicos de mamíferos. Distintos genes raf codifican para A-Raf, B-Raf y Raf-1 (también conocidos como c-Raf) en vertebrados (revisado en Papin et al., 1998, Oncogene 12:2218-2221). Las tres proteínas no son iguales en su capacidad para activar MEK. A-Raf, el elemento peor caracterizado de la familia, parece ser un mal activador de MEK, resultando díficil la medición de su actividad (Pritchard et al., 1995, Mol. Cell. Biol. 15, 6430-6442). B-Raf y Raf-1 también difieren en su capacidad para activar MEK. Mientras que Raf-1 se expresa de manera ubicua, B-Raf presenta los niveles de expresión más altos en los tejidos neurales (Barnier et al., 1995, J. Biol. Chem. 270, 23381-23389). Sin embargo, se ha identificado B-Raf como el principal activador de MEK, incluso en células en las que su expresión apenas puede detectarse mediante análisis de inmunotransferencia de tipo Western (Catling et al., 1994; Jaiswal et al., 1994; Reuter et al., 1995; Huser et al., 2001; Mikula et al., 2001). Consecuentemente, B-Raf presenta una afinidad mayor por MEK-1 y MEK-2 que Raf-1 (Papin et al., 1996; Papin et al., 1998) y es más eficaz en la fosforilación del MAPKK MEK.

El activador anterior de B-Raf es la Ras GTPasa. Es conocido que existen varias isoformas de Ras en mamíferos; N-Ras, Ha-Ras, Ki-Ras4A y Ki-Ras4B. Otras GTPasas de la superfamilia de Ras también puede interaccionar con B-Raf. Por ejemplo Rap-1, revisado en Peysonnaux et al., (2001) Biology of the Cell 93:53-62 parece que es un activador selectivo de B-Raf.

Sumario de la invención

En la presente memoria se describen mutaciones puntuales en los productos del gen B-raf. Las mutaciones puntuales descritas se identifican en tumores humanos de origen natural. Estas mutaciones puntuales están asociadas con fenotipos cancerosos y pueden utilizarse como base para el diagnóstico del cáncer, las células cancerosas o una predisposición al cáncer en sujetos humanos.

Dado que muchas de la(s) ruta(s) de señalización que están mediadas por la activación de la actividad cinasa de B-Raf están implicadas en el control de la proliferación celular y la transformación oncogénica, sería deseable que pudieran detectarse rápidamente cambios en el gen B-raf que pueden dar como resultado un carácter oncogénico.

Por tanto, en un primer aspecto, se proporciona un mutante asociado con cáncer que se produce de manera natural de un polipéptido B-Raf humano que comprende una o más mutaciones.

Preferentemente, el mutante asociado con cáncer se aísla de un tumor humano primario que se produce de manera natural.

Preferentemente,... [Seguir leyendo]

1. Polipéptido B-Raf humano mutante que se produce de manera natural aislado que comprende una o más mutaciones somáticas de aminoácidos asociadas al cáncer, en el que las mutaciones de aminoácidos se producen en una o más de las posiciones 463, 465, 468, 585, 594, 595, 596 y 599 en B-Raf que presenta la secuencia:

2. Mutante según la reivindicación 1, en el que las mutaciones de un solo aminoácido se seleccionan de entre el

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10 grupo constituido por V599E, V599D, G595R, G465V, G465E, G465A, G468A, G468E, E585K, F594L, G595R, L596V, L596R y G463E.

3. Complemento de un ácido nucleico seleccionado de entre el grupo constituido por: un ácido nucleico que codifica un polipéptido B-Raf según la reivindicación 1 ó 2; un ácido nucleico que codifica un polipéptido B-Raf según la reivindicación 1 ó 2, en el que el ácido nucleico comprende una o más mutaciones puntuales; y un ácido nucleico que codifica un polipéptido B-Raf según la reivindicación 1 ó 2 que comprende una o más mutaciones puntuales, en el que dicha mutación puntual se produce en una o más de las posiciones 1388, 1394, 1403, 1753, 1782, 1783, 1796, 1797, 1787 y 1786 de B-raf; y un ácido nucleico que codifica un polipéptido BRaf según la reivindicación 1 ó 2, que comprende una o más mutaciones puntuales, en el que dicha mutación puntual es G1388T, G1783C, TG1796-97AT, G1394T, G1394A, G1394C, G1403C, G1403A, G1753A, T1782G, G1388A, T1796A, T1787G o C1786G en B-raf; en el que B-raf presenta la secuencia:

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4. Ácido nucleico que se hibrida específicamente con un ácido nucleico mutante seleccionado de entre el grupo constituido por: un ácido nucleico mutante que codifica un polipéptido B-Raf según la reivindicación 1 ó 2, en el que el ácido nucleico se hibrida específicamente con una o más mutaciones puntuales en el ácido nucleico mutante, en el que dicha mutación puntual se produce en una o más de las posiciones 1388, 1394, 1403, 1753, 1782, 1783, 1796, 1797, 1787 y 1786 de B-raf que presenta la secuencia definida en la reivindicación 3; y un ácido nucleico mutante que codifica un polipéptido B-Raf según la reivindicación 1 ó 2, en el que el ácido nucleico se hibrida específicamente con una o más mutaciones puntuales en el ácido nucleico mutante, en el que dicha mutación puntual es G1388T, G1783C, TG1796-97AT, G1394T, G1394A, G1394C, G1403C, G1403A, G1753A, T1782G, G1388A, T1796A, T1787G o C1786G en B-raf que presenta la secuencia definida en la reivindicación 3.

5. Ligando que se une selectivamente a un epítopo mutante del polipéptido B-Raf según la reivindicación 1 ó 2, comprendiendo el epítopo mutante una mutación de aminoácido tal como se define en la reivindicación 1.

6. Ligando según la reivindicación 5, que es una inmunoglobulina.

7. Ligando según la reivindicación 6, que es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

8. Procedimiento para la detección de las mutaciones oncogénicas, que comprende las etapas siguientes:

(a) proporcionar una muestra de material celular que se produce de manera natural de un sujeto humano;

(b) examinar el material de ácido nucleico de por lo menos parte de uno o más genes B-raf en dicho material celular; y

(c) determinar si tal material de ácido nucleico comprende una o más mutaciones puntuales en una secuencia que codifica un polipéptido B-Raf,

en el que dicha mutación puntual se produce en una o más de las posiciones 1388, 1394, 1403, 1753, 1782, 1783, 1796, 1797, 1787 y 1786 de B-raf que presenta la secuencia definida en la reivindicación 3.

9. Procedimiento para la detección de las mutaciones oncogénicas, que comprende las etapas que consisten en:

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(a) proporcionar una primera muestra de material celular obtenida de un tejido que se produce de manera natural de un sujeto que se sospecha que es canceroso, y una segunda muestra de material celular de un tejido no canceroso del mismo sujeto;

(b) examinar el material de ácido nucleico de por lo menos parte de uno o más genes B-raf en ambas de dichas muestras de material celular; y

(c) determinar si tal material de ácido nucleico comprende una o más mutaciones puntuales en una secuencia que codifica un polipéptido B-RAF; y estando dicha mutación presente en el material celular que se produce de manera natural del tejido que se sospecha que es canceroso pero no presente en el material celular del tejido no canceroso, en el que dicha mutación puntual se produce en una o más de las posiciones 1388, 1394, 1403, 1753, 1782, 1783, 1796, 1797, 1787 y 1786 de B-raf que presenta la secuencia definida en la reivindicación 3.

10. Procedimiento según la reivindicación 8 ó 9, en el que dicha mutación puntual es G1388T, G1783C, TG179697AT, G1394T, G1394A, G1394C, G1403C, G1403A, G1753A, T1782G, G1388A, T1796A, T1787G o C1786G en Braf que presenta la secuencia definida en la reivindicación 3.

11. Procedimiento para la detección de mutaciones oncogénicas, que comprende las etapas que consisten en:

(a) obtener una muestra de material celular de un sujeto;

(b) cribar dicha muestra con un ligando según las reivindicaciones 5 a 7; y

(c) detectar uno o más polipéptidos B-Raf mutantes tal como se define en la reivindicación 1 ó 2 en dicha muestra.

12. Procedimiento automatizado para detectar una mutación en una posición de la secuencia diana en un ácido nucleico que codifica un polipéptido B-Raf, que comprende:

secuenciar una muestra de un producto de amplificación del ácido nucleico para proporcionar un conjunto de datos de muestra que especifica los datos de identificación de pares de bases medidos en un dominio diana que se extiende desde una posición de inicio de la secuencia hasta una posición final de la secuencia;

determinar la presencia o la ausencia de la mutación en la muestra condicionado a si el dato de identificación de pares de bases medido para la posición diana de la secuencia corresponde a un dato de pares de bases de referencia para la posición diana de la secuencia; y

generar una salida que indica la presencia o la ausencia de la mutación en la muestra tal como se establece mediante la etapa de determinación;

en el que el ácido nucleico comprende una o más mutaciones puntuales; y en el que dicha mutación puntual se produce en una o más de las posiciones 1388, 1394, 1403, 1753, 1782, 1783, 1796, 1797, 1787 y 1786 de B-raf que presenta la secuencia definida en la reivindicación 3.

13. Procedimiento automatizado para detectar una mutación de un solo aminoácido en un polipéptido B-Raf, que comprende:

aplicar un marcador a uno o más aminoácidos diana en una muestra del polipéptido B-Raf;

leer la muestra tras aplicar el marcador para determinar la presencia o la ausencia del marcador en la muestra, para indicar así la presencia o la ausencia de la mutación de un solo aminoácido en la muestra, y

generar una salida que indica la presencia o ausencia de la mutación de un solo aminoácido en la muestra tal como se determina mediante la etapa de lectura; en el que el polipéptido B-Raf comprende una o más mutaciones tal como se define en reivindicación 1.

14. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que el marcador comprende un ligando que se une preferentemente a un polipéptido B-Raf que lleva la mutación de un solo aminoácido.

15. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que el marcador comprende un ligando que se une preferentemente a un polipéptido B-Raf de un tipo natural sin la mutación de un solo aminoácido.

16. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que marcador es un anticuerpo.

17. Procedimiento según la reivindicación 13, que comprende un procedimiento de ELISA.

18. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que el marcador se aplica utilizando un dispositivo de creación de micromatrices.

19. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que la muestra se lee de manera óptica.

20. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que la salida se genera utilizando un dispositivo que comprende por lo menos uno de: una interfaz de usuario gráfica; una interfaz de usuario audible, una impresora, un medio de almacenamiento legible por ordenador; y un medio de soporte que pueda interpretarse por ordenador.

21. Procedimiento para identificar uno o más compuestos que presentan actividad antiproliferativa, que comprende las etapas que consisten en:

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(a) proporcionar uno o más polipéptidos B-Raf mutantes según la reivindicación 1 ó 2;

(b) poner en contacto dicho(s) polipéptido(s) con uno o más compuestos que van a someterse a prueba; y

(c) detectar una interacción entre dichos uno o más compuestos y dichos polipéptidos mutantes.

22. Procedimiento según la reivindicación 21, en el que la interacción es una interacción de unión.

23. Ensayo para identificar uno o más compuestos que presentan actividad antiproliferativa, que comprende las etapas que consisten en:

(a) proporcionar uno o más polipéptidos B-Raf mutantes según la reivindicación 1 ó 2;

(b) proporcionar un sustrato posterior para el polipéptido B-Raf;

(c) detectar la modificación del sustrato en presencia del/de los compuesto(s) que va(n) a someterse a prueba.

24. Ensayo según la reivindicación 23, en el que la modificación del sustrato se detecta directamente.

25. Ensayo según la reivindicación 24, en el que el sustrato es una enzima que modifica un segundo sustrato, pudiéndose detectar dicha segunda modificación.

26. Ensayo según la reivindicación 25, en el que el sustrato es MEK y el segundo sustrato es MAPK.

27. Procedimiento o ensayo según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 26, en el que se determina un nivel de referencia para el ensayo en ausencia del compuesto o de los compuestos que va(n) a someterse a prueba.

28. Cinasa activa de manera constitutiva que comprende una mutación en el bucle de unión al fosfato de la misma seleccionada de entre el grupo constituido por G463V y G468A de B-Raf que presenta la secuencia definida en la reivindicación 1.

29. Cinasa según la reivindicación 28, que es una B-Raf proteína cinasa.

30. Procedimiento para el cribado de uno o más compuestos para un efecto inhibidor en una cinasa, que comprende

(a) preparar una cinasa mutante que comprende una sustitución, deleción o inserción de aminoácido según cualquiera de las reivindicaciones 28 y 29;

(b) exponer la cinasa mutante a dichos uno o más compuestos en presencia de un sustrato de cinasa; y

(c) determinar la capacidad de la cinasa para fosforilar el sustrato en presencia de uno o más compuestos.