Un procedimiento de cribado de un modulador de la actividad de interleucina 32 (IL-32) basado en la unión de IL-32 a la proteinasa 3 (PR-3),

que comprende determinar la unión de IL-32 a PR-3 en presencia de un modulador candidato, comparar el nivel de dicha unión con el nivel de unión de IL-32 a PR-3 en ausencia de dicho modulador candidato, y seleccionar un modulador capaz de inhibir o potenciar dicha unión, en el que la actividad de IL-32 es al menos una seleccionada de la inducción de MIP-2, la inducción de TNF, y la inducción de IL-8

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a procedimientos para cribar moduladores de interleucina 32 (IL-32), a fragmentos de IL-32 y a su uso. 5

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Interleucina-32 (IL-32) fue identificada inicialmente en 1992 por Dahl y col. como una molécula tipo citocina denominada transcrito 4 de células asesinas naturales (NK4). Debido a su identificación inicial en 10 1992, NK4 no se ha estudiado en extensión y el término NK4 (o NK-4) se asignó también a otras proteínas no relacionadas [Kim, 1989; Smart, 1989; Date, 1997].

Se ha informado del incremento en la expresión génica de NK4 en células mononucleares de la sangre 15 periférica (PBMC) de pacientes que reciben terapia contra el melanoma maligno con elevadas dosis de IL-2, pero no se ha determinado su función [Panelli, 2002].

Kim y col. (2005) han informado recientemente de que la estimulación de células macrófagas Raw 264.7 con NK4 20 recombinante indujo la secreción de grandes cantidades de TNF-α en estas células. Por tanto, se reconoció a NK4 como citocina proinflamatoria y se renombró como IL-32 [Kim, 2005].

El gen que codifica IL-32 reside en el cromosoma 25 humano 16 p13.3. El gen IL-32 contiene ocho exones. Se detectaron cuatro variantes de corte y empalme del ARNm de IL-32 que codificaban las isoformas IL-32α, IL-32β, IL-32δ e IL-32γ en las células asesinas naturales humanas (NK), y se identificó que la isoforma IL-32γ era idéntica al 30 transcrito anteriormente informado como transcrito NK4 [Kim, 2005]. El transcrito IL-32γ, que incluye los exones 3 y 4, codifica una isoforma de proteína que tiene 46 aminoácidos adicionales en el extremo N-terminal. En el transcrito IL-32δ, el segundo exón está ausente y el 35 inicio de la traducción se produce en un codón ATG presente en el tercer exón. A diferencia de otras variantes, el transcrito IL-32α carece de los exones 7 y 8 y codifica una isoforma de proteína que tiene 57 residuos de aminoácidos desaparecidos en su extremo C-terminal. De 5 entre los cuatro transcritos IL-32, el transcrito IL-32α es el más abundante, por tanto, se caracterizó IL-32α con mayor amplitud. El análisis de la secuencia de aminoácidos de la isoforma IL-32α desveló tres potencialessitios de N-miristoilación y un sitio de N-glicosilación [Kim, 2005]. 10

Se ha informado de que IL-32α y β inducen la secreción de cantidades significativas del factor α de necrosis tumoral (TNF-α) y de la proteína 2 inflamatoria de macrófagos (MIP-2) en una manera dependiente de la dosis a partir de células THP-1 diferenciadas mediante PMA 15 y a partir de células Raw de ratón. Se informó que IL-32-α y β recombinantes (rIL-32-α y β) inducen la producción de IL-8 en células THP-1 monocíticas humanas no diferenciadas. Se encontró que un fragmento Fab de un anticuerpo monoclonal dirigido contra rIL-32β reduce la 20 actividad biológica de r-IL-32α en hasta un 70 % en una manera dependiente de la dosis. A nivel transcripcional, se detectó el ARNm de IL-32 de 1,2 KB en diversos tejidos, pero fue más prominente en células inmunes que en tejidos no inmunes (Kim, 2005). 25

Células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC), que contienen en su mayor parte células T, produjeron y secretaron IL-32 tras estimulación con Con A (que induce principalmente la estimulación de células T). No se detectó la producción o secreción de IL-32 tras la 30 estimulación de PBMC con lipopolisacáridos (que inducen principalmente la estimulación de macrófagos). Estos resultados sugieren que las células T son las productoras principales de IL-32. Sin embargo, se encontró que la estimulación de líneas de células epiteliales con IFN-35 gamma induce la producción de IL-32.

La actividad proinflamatoria de IL-32 parece estar mediada por la degradación de I-κB, que conduce a la activación de NF-κB. Sin embargo, se ha informado también de la activación de la quinasa MAP por IL-32α [Kim, 2005]. 5

La proteinasa 3 (PR-3, conocida también como mieloblastina, PR-3 neutrófilo y autoantígeno de Wegener) es una gránulo serina proteasa producida por los neutrófilos/monocitos y es capaz de procesar múltiples sustratos biológicos [Baggiolini, 1978; Kao, 1988]. PR-3 10 degrada una variedad de proteínas de la matriz extracelular, que incluyen elastina, fibronectina, colágeno de tipo IV, y laminina e inactiva p65 NF-κB [Preston, 2002]. PR-3 escinde muchas prohormonas y citocinas incluyendo el angiotensinógeno, TGF-β1, IL-1β, 15 IL-8 y TNF-α unido a membrana en su forma activa [Ramaha, 2002; Csernok, 1996; Coeshott, 1999; Padrines, 1994; Robache-Gallea, 1995]. De hecho, se encontraron títulos elevados de autoanticuerpos de PR-3 (véase a continuación) que bloqueaban completamente la escisión de TNF-α. 20

PR-3, que aparece en las formas tanto soluble como de membrana celular, es el autoantígeno principal en la granulomatosis de Wegener (GW). La granulomatosis de Wegener es la vasculitis sistémica necrotizante autoinmune más común en adultos y se manifiesta principalmente en el 25 tracto respiratorio y los riñones [Lamprecht, 2004; Frosch, 2004].

Los autoanticuerpos contra PR-3, conocidos como "autoanticuerpos citoplásmicos dirigidos contra neutrófilos" (ANCA) son un factor distintivo en el 30 diagnóstico de GW [van Rossum, 2003; Jennette, 1997]. Se encontró que el fenotipo con elevado PR-3 de membrana (mPR-3) era significativamente mayor en pacientes con vasculitis asociada a ANCA y en pacientes con artritis reumatoide. Por lo tanto, la expresión de PR-3 de membrana 35 es un factor de riesgo de vasculitis y artritis reumatoide [Witko-Sarsat, 1999]. La expresión de PR-3 en las membranas de las células neutrófilas está relacionada con la recaída en la vasculitis asociada a los autoanticuerpos citoplásmicos dirigidos contra neutrófilos (ANCA) PR-3. 5 Los pacientes con vasculitis en vasos pequeños tienen niveles mayores de proteína PR-3 circulante en su plasma [Ohlsson, 2003]. Niveles elevados de expresión de PR-3 en la membrana de los neutrófilos son también un factor de riesgo de GW y se asocian con la recaída de la enfermedad 10 GW (Rarok AA; Stegeman CA, Limburg PC, Kallenberg CG. J Am Soc Nephrol. 2002 Sep; 13(9): 2232-8.

Aparentemente, la patogénesis de GW está inducida por la unión de ANCA al antígeno de PR-3 presente en la superficie de neutrófilos y monocitos. La unión de ANCA a 15 neutrófilos y monocitos produce la activación celular, el estallido respiratorio y la liberación de radicales de oxígeno tóxico y de enzimas proteolíticas. La exposición de PR-3 en la superficie celular y la unión de autoanticuerpos dirigidos contra PR-3 a neutrófilos 20 parecen facilitar la autoinmunización y la amplificación de la inflamación vascular inducida por neutrófilos.

Los perfiles de expresión génica de los neutrófilos y los monocitos maduros periféricos de pacientes que padecen enfermedades ANCA manifestadas en el riñón 25 mostraron niveles elevados de transcritos de un grupo de genes que se expresan normalmente sólo en células precursoras de la médula ósea ("desviación hacia la izquierda"). El transcrito PR-3 está incluido en este grupo de genes aumentados y el incremento de la expresión 30 de PR-3 correlacionado con la actividad de la enfermedad y con la glomerulonefritis [Muller Kobold, 1998; Yang, 2004; Yang, 2002].

Los pacientes con fibrosis quística (FQ) tienen aumentado el ARNm de PR-3 en los monocitos circulantes en 35 el momento de la exacerbación pulmonar [Just, 1999]. La proteína D surfactante (SP-D) es una importante molécula de defensa innata del huésped presente en el pulmón de los pacientes afectados de FQ, que interactúa con los patógenos asociados con FQ [von Bredow, 2003]. SP-D es una 5 proteína diana de PR-3. De esta manera, en los pacientes con FQ, parece estar afectada la defensa del huésped debido a la proteólisis de SP-D por PR-3, incrementándose por tanto la incidencia de la infección del pulmón en estos pacientes. 10

En pacientes con las encías inflamadas, se encontró que PR-3 funcional se expresaba en las células epiteliales orales y se encontró ANCA en el suero del paciente. Dichas células epiteliales que expresan PR-3 funcional parecen participar en los procesos inflamatorios de las encías, 15 que incluyen gingivitis y periodontitis [Uehara, 2004].

Además de actuar sobre la superficie celular...

1. Un procedimiento de cribado de un modulador de la actividad de interleucina 32 (IL-32) basado en la unión de IL-32 a la proteinasa 3 (PR-3), que comprende 5

determinar la unión de IL-32 a PR-3 en presencia de un modulador candidato,

comparar el nivel de dicha unión con el nivel de unión de IL-32 a PR-3 en ausencia de dicho modulador candidato, y

seleccionar un modulador capaz de inhibir o potenciar 10 dicha unión,

en el que la actividad de IL-32 es al menos una seleccionada de la inducción de MIP-2, la inducción de TNF, y la inducción de IL-8.

15

2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha unión de IL-32 a PR-3 se mide mediante resonancia de plasmón superficial.

3. El procedimiento según la reivindicación 1 y 2, en 20 el que dicho modulador inhibe la unión de IL-32 a PR-3.

4. El procedimiento según la reivindicación 3, en el que el modulador es un inhibidor de la actividad de IL-32.

25

5. El procedimiento según la reivindicación 4, en el que el modulador es un inhibidor de la actividad inflamatoria de IL-32.

6. El procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en 30 el que dicho modulador potencia la unión de IL-32 a PR-3.

7. El procedimiento según la reivindicación 6, en el que el modulador es un potenciador de la actividad de IL-32. 35

8. Un procedimiento de cribado de un inhibidor de la actividad de interleucina 32 (IL-32) basado en la actividad proteolítica de la proteinasa 3 (PR-3) sobre IL-32, que comprende 5

determinar la proteólisis de IL-32 por PR-3 en presencia de un inhibidor candidato y

seleccionar un inhibidor capaz de inhibir la aparición de un fragmento de IL-32 generado por la actividad proteolítica de PR-3 o la desaparición de la IL-32 10 intacta, en el que la actividad de IL-32 es al menos una seleccionada de la inducción de MIP-2, la inducción de TNF, y la inducción de IL-8.

9. El procedimiento según la reivindicación 8, en el 15 que dicho inhibidor inhibe la actividad inflamatoria de IL-32.

10. El procedimiento según la reivindicación 8 ó 9, en el que dicho fragmento de IL-32 es de aproximadamente 16 20 kDa.

11. El procedimiento según la reivindicación 8 ó 9, en el que dicho fragmento de IL-32 es de aproximadamente 13 kDa. 25

12. Un procedimiento de cribado de un inhibidor de la actividad de interleucina 32 (IL-32) basado en el potenciamiento de la secreción de citocina mediada por IL-32 por la proteinasa 3 (PR-3) en una célula sensible a IL-30 32, que comprende

poner en contacto IL-32 y PR-3 con una célula sensible a IL-32 en presencia de un inhibidor candidato,

determinar la concentración de una citocina en el medio de cultivo de dicha célula, 35

comparar con la concentración de dicha citocina en el medio de cultivo de dicha célula en ausencia de dicho inhibidor candidato, y

seleccionar un inhibidor capaz de inhibir dicha secreción de citocina, en el que la actividad de IL-32 es al menos 5 una seleccionada de la inducción de MIP-2, la inducción de TNF, y la inducción de IL-8 y en el que la citocina se selecciona del grupo que consiste en TNF, IL-8 y MIP-2.

13. El procedimiento según la reivindicación 12, en el 10 que dicho inhibidor inhibe la actividad inflamatoria de IL-32.

14. El procedimiento según la reivindicación 12 ó 13, en el que la célula sensible a IL-32 es una célula T o una 15 célula macrófaga.

15. Un procedimiento de cribado de un modulador de la actividad de interleucina 32 (IL-32) o de la actividad de uno de sus fragmentos, que comprende 20

estimular una célula sensible a IL-32 con un fragmento de IL-32 generado por la actividad proteolítica de PR-3 en presencia de un modulador candidato,

determinar la concentración de una citocina secretada al medio de cultivo de dicha célula, 25

comparar con la concentración de dicha citocina secretada al medio de cultivo de dicha célula en ausencia de dicho modulador candidato y

seleccionar un modulador capaz de inhibir o potenciar la secreción de dicha citocina a partir de dicha 30 célula,

en el que el fragmento de IL-32 generado por la actividad proteolítica de PR-3 es un fragmento de aproximadamente 16 kDa o de aproximadamente 13 kDa, y

en el que la actividad de IL-32 o del fragmento de 35 IL-32 es al menos una seleccionada de la inducción de MIP-2, la inducción de TNF, y la inducción de IL-8 y en el que la citocina se selecciona del grupo que consiste en TNF, IL-8 y MIP-2.

5

16. El procedimiento según la reivindicación 15, en el que la célula sensible a IL-32 es una célula T o una célula macrófaga.

17. El procedimiento de cribado según una cualquiera de 10 las reivindicaciones 15 a 16, en el que el modulador es un inhibidor de la actividad inflamatoria de IL-32.

18. Un fragmento de polipéptido de IL-32 obtenido mediante la proteólisis de IL-32 por la proteinasa 3 (PR-15 3).

19. Un fragmento de polipéptido según la reivindicación 18, en el que el fragmento de IL-32 es el fragmento de aproximadamente 16 kDa obtenido mediante la proteólisis de 20 IL-32 por la proteinasa 3 (PR-3) o,

(i) una de sus muteínas, que tiene un 80 % de identidad de la secuencia con la SEQ ID NO:2 y que retiene la actividad biológica de IL-32,

(ii) una de sus proteínas de fusión o 25

(iii) una de sus fracciones activas, que retiene la actividad biológica de IL-32,

en el que la actividad biológica de IL-32 es al menos una seleccionada de la inducción de MIP-2, la inducción de TNF, y la inducción de IL-8. 30

20. Un fragmento de polipéptido según la reivindicación 18, en el que el fragmento de IL-32 es el fragmento de aproximadamente 13 kDa obtenido mediante la proteólisis de IL-32 por la proteinasa 3 (PR-3) o, 35

(i) una de sus muteínas, que tiene un 80 % de identidad de la secuencia con la SEQ ID NO: 1 y que retiene la actividad biológica de IL-32,

(ii) una de sus proteínas de fusión, o

(iii) una de sus fracciones activas, que retiene la 5 actividad biológica de IL-32

en el que la actividad biológica de IL-32 es al menos una seleccionada de la inducción de MIP-2, la inducción de TNF, y la inducción de IL-8.

10

21. Una composición farmacéutica que comprende un fragmento de polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

15

22. El fragmento de polipéptido de IL-32 que consiste en la SEQ ID NO: 1 o,

(i) una de sus muteínas, que tiene un 80 % de identidad de la secuencia con la SEQ ID NO: 1 y que retiene la actividad biológica de IL-32, 20

(ii) una de sus proteínas de fusión, o

(iii) una de sus fracciones activas, que retiene la actividad biológica de IL-32

en el que la actividad biológica de IL-32 es al menos una seleccionada de la inducción de MIP-2, la inducción de 25 TNF, y la inducción de IL-8.

23. El fragmento de polipéptido de IL-32 que consiste en la SEQ ID NO: 2 o

(i) una de sus muteínas, que tiene un 80 % de 30 identidad de la secuencia con la SEQ ID NO: 2 y que retiene la actividad biológica de IL-32,

(ii) una de sus proteínas de fusión, o

(iii) una de sus fracciones activas, que retiene la actividad biológica de IL-32 35

en el que la actividad biológica de IL-32 es al menos una seleccionada de la inducción de MIP-2, la inducción de TNF, y la inducción de IL-8.

24. Una composición farmacéutica que comprende el 5 fragmento de polipéptido de IL-32 que consiste en la SEQ ID NO: 1 o,

(i) una de sus muteínas, que tiene un 80 % de identidad de la secuencia con la SEQ ID NO: 1 y que retiene la actividad biológica de IL-32, 10

(ii) una de sus proteínas de fusión, o

(iii) una de sus fracciones activas, que retiene la actividad biológica de IL-32,

y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en el que la actividad biológica de IL-32 es al menos una seleccionada 15 de la inducción de MIP-2, la inducción de TNF, y la inducción de IL-8.

25. Una composición farmacéutica que comprende el fragmento de polipéptido de IL-32 que consiste en la SEQ 20 ID NO: 2 o,

(i) una de sus muteínas, que tiene un 80 % de identidad de la secuencia con la SEQ ID NO: 2 y que retiene la actividad biológica de IL-32,

(ii) una de sus proteínas de fusión, o 25

(iii) una de sus fracciones activas, que retiene la actividad biológica de IL-32,

y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en el que la actividad biológica de IL-32 es al menos una seleccionada de la inducción de MIP-2, la inducción de TNF, y la 30 inducción de IL-8.