MODIFICADORES DE LA EMISIÓN LUMÍNICA Y USOS DE LOS MISMOS EN LA DETECCIÓN, AMPLIFICACIÓN Y ANÁLISIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS.

Modificadores de la emisión lumínica y usos de los mismos en la detección, amplificación y análisis de ácidos nucleicos Campo de la invención La presente invención se refiere a los campos de la biología molecular y de la química de los ácidos nucleicos. En determinadas realizaciones, se proporcionan métodos y reactivos para modificar la emisión de luz a partir de ácidos nucleicos marcados, con el fin de llevar a cabo la detección, análisis y cuantificación homogéneas en tiempo real de secuencias de ácidos nucleicos utilizando sondas de marcaje único. Además, también se describe la utilización de dichos modificadores de la emisión lumínica en la reducción del fondo y en otros usos. Antecedentes de la invención El desarrollo de la tecnología de amplificación de ácidos nucleicos (NAT) ha revolucionado la ciencia del análisis e ingeniería genéticas. Por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se utiliza comúnmente para amplificar ácidos nucleicos diana específicos utilizando ácidos nucleicos cebadores seleccionados, por ejemplo para facilitar la detección del ácido nucleico diana como parte de una aplicación diagnóstica, forense u otra aplicación. Los cebadores típicamente funcionan en parejas que se diseñan para la extensión de una hacia la otra para cubrir la región diana seleccionada. Un ciclo de PCR típico incluye una etapa de desnaturalización a temperatura elevada (por ejemplo 85ºC o más) durante la que las cadenas de los ácidos nucleicos de doble cadena se separan, una etapa de hibridación a baja temperatura (por ejemplo 45ºC a 65ºC) durante la que los cebadores se hibridan con las cadenas individuales separadas, y una etapa de extensión a temperatura intermedia (por ejemplo aproximadamente 72ºC), durante la que una ácido-nucleico polimerasa extiende los cebadores. También se utilizan procedimientos de termociclado a dos temperaturas. Estos procedimientos generalmente incluyen una etapa de desnaturalización a temperatura elevada y una etapa de hibridación-extensión a temperatura reducida. Para producir una cantidad detectable del producto de PCR o amplicón particular, estos ciclos generalmente se repiten entre aproximadamente 25 y 45 veces. También se describen PCRs en muchas patentes US diferentes, incluyendo, por ejemplo, la patente US nº 4.683.195, patente US nº 4.683.202 y la patente US nº 4.965.188. Ademástambién se describen técnicas de tipo PCR en diversas otras publicaciones, tales como Innis et al. (editores), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Elsevier Science & Technology Books, 1990; Innis et al. (editores), PCR Applications: Protocols for Functional Genomics, Academic Press, 1999; Edwards et al., Real Time PCR, Taylor & Francis, Inc., 2004, y Rapley et al., Molecular Analysis and Genome Discovery, John Wiley & Sons, Inc., 2004. También se han desarrollado muchas variaciones de la técnica PCR, así como otras técnicas de amplificación de ácidos nucleicos. Entre los ejemplos de ellas se incluyen la PCR de transcripción inversa (RT-PCR) (Joyce, 2002, Quantitative RT-PCR. A review of current methodologies, Methods Mol. Biol. 193:83-92, y Emrich et al., 2002, Quantitative detection of telomerase componentes by real-time, online RT-PCR analysis with the LightCycler, Methods Mol. Biol. 191:99-108), la reacción en cadena de la ligasa (LCR) (Lee, 1996, Ligase chain reaction, Biologicals 24(3):197-9), la reacción en cadena de la polimerasa/ligasa (Barany et al., 1991, The ligase chain reaction in a PCR world, PCR Methods Appl. 1(1):5-16), la Gap-LCR (Abravaya et al., 1995, Detection of point mutations with a modified ligase chain reaction (Gap-LCR), Nucleic Acids Res. 23(4):675-82), la amplificación por desplazamiento de cadena (Walker, 1993, Empirical aspects of strand displacement amplification, PCR Methods Appl. 3(1):1-6), la amplificación lineal ligada (LLA) (Killeen et al., 2003, Linked linear amplification for simultaneous analysis of the two most common hemochromatosis mutations, Clin. Chem. 49(7):1050-7), amplificación por círculo rodante (RCA) (Nilsson et al., 2002, Real-time monitoring of rolling-circle amplification using a modified molecular beacon design, Nucleic Acids Res. 30(14):e66), la amplificación mediada por transcripción (TMA) (Emery et al., 2000, Evaluation of performance of the Gen-Probe human immunodeficiency virus type 1 viral load assay using primary subtype A, C, and D isolates from Kenya, J. Clin. Microbiol. 38:2688-2695), la amplificación basada en una secuencia de ácidos nucleicos (NASBA) (Mani et al., 1999, Plasma RNA viral load as measured by the branched DNA and nucleic acid sequence-based amplification assays of HIV-1, J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 22:208-209, y Berndt et al., 2000, Comparison between a nucleic acid sequence-based amplification and branched DNA test for quantifying HIV RNA load in blood plasma, J. Virol. Methods 89:177-181), y replicación de secuencia autosostenida (3SR) (Mueller et al., 1997, Self-sustained sequence replication (3SR): an alternative to PCR, Histochem. Cell Biol. 108:431-7). Se han desarrollado diversas estrategias para detectar productos de amplificación, incluyendo aquéllas que implican sondas 5-nucleasa, balizas moleculares o cebadores SCORPION ® , entre muchos otros. A título ilustrativo, una ensayo de 5-nucleasa típicamente utiliza la actividad nucleasa 5 a 3 de determinadas ADN polimerasas para cortar las sondas 5-nucleasa durante el curso de una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Estos ensayos permiten tanto amplificar una diana como liberar marcajes para la detección, generalmente sin recurrir a múltiples etapas de manipulación de los productos amplificados. Algunas sondas 5-nucleasa incluyen grupos de marcaje, tales como un pigmento informador fluorescente y un pigmento receptor. En el caso de que la sonda se encuentre intacta, la proximidad del pigmento informador al pigmento receptor generalmente resulta en la supresión de la fluorescencia 2 ES 2 365 893 T3 del informador. Sin embargo, en muchos casos una sonda intacta produce una determinada cantidad de fluorescencia residual o de línea base. Durante una reacción de 5-nucleasa, el corte de la sonda separa el pigmento informador del pigmento receptor, resultando en un incremento detectable de fluorescencia procedente del informador. La acumulación de productos de PCR o de amplicones típicamente se detecta indirectamente mediante el seguimiento de este incremento de fluorescencia en tiempo real. Aunque muchos formatos preexistentes de detección de amplificación de ácidos nucleicos son simples y robustos, siguen existiendo algunos problemas. Por ejemplo, muchos de dichos formatos de detección utilizan sondas con marcaje doble (por ejemplo una sonda que incluye grupos donantes y aceptores). La fabricación de estas sondas de marcaje doble generalmente implica procedimientos de síntesis, purificación y control de la calidad que son complejos, laboriosos y caros. Además, la fluorescencia de línea base de las sondas de marcaje doble típicamente debe encontrarse comprendida en un intervalo determinado de rendimiento óptimo. Además, determinadas sondas de marcaje doble pueden adolecer de inestabilidad, resultando en la deriva de la línea base, lo que impacta negativamente sobre el tiempo de almacenamiento. Además, la inserción de un marcaje interno típicamente conduce, tras la hibridación, a la desestabilización del dúplex, que generalmente es necesario compensar. Todos los problemas anteriormente indicados pueden evitarse utilizando sondas de marcaje único no desactivadas para detectar los productos de las reacciones de amplificación de ácidos nucleicos. Por ejemplo, se ha descrito la utilización de bromuro de etidio y de algunos otros pigmentos ligantes de ADN para desactivar la fluorescencia de los oligonucleótidos de una manera dependiente de la longitud de secuencia. La patente EP nº 0 699 768 da a conocer métodos para la detección de una sonda oligonucleótida que se marca con un marcaje emisor de luz que contiene una secuencia que es capaz de hibridarse con un ácido nucleico diana en presencia de un compuesto ligante de ADN (es decir, bromuro de etidio, naranja de acridina y agentes ligantes de ADN no intercalantes, tales como verde malaquita). La patente WO nº 99/28500 se refiere a un método para detectar la presencia de un ácido nucleico diana en una muestra, en la que un agente ligante de dúplex de ADN (es decir SYBR verde 1) no capaz de unirse a ácidos nucleicos monocatenarios se añade a la muestra con el fin de absorber energía fluorescente de una sonda o de donar energía fluorescente a una sonda, comprendiendo la sonda una molécula reactiva. Sin embargo, estos pigmentos generalmente no pueden utilizarse para la detección en tiempo real, por ejemplo debido a su reducida afinidad de unión al ADN a temperaturas más... [Seguir leyendo]

1. Método para la determinación de la temperatura de fusión (Tm) de un complejo de hibridación, comprendiendo el método: (a) proporcionar: (i) una sonda que comprende un grupo emisor de luz, (ii) una diana de hibridación que es complementaria, o parcialmente complementaria, a dicha sonda, (iii) un modificador soluble de la emisión lumínica que comprende un pigmento tiazina o un pigmento diazina, en el que dicho modificador soluble de la emisión lumínica es capaz de desactivar dicho grupo emisor de luz, (b) hibridar dicha sonda con dicha diana de hibridación bajo condiciones en las que se produce el apareamiento de bases formando un complejo de hibridación diana, (c) alterar la temperatura de dicho complejo de hibridación diana en presencia de dicho modificador soluble de la emisión lumínica y medir una emisión de dicho grupo emisor de luz, (d) correlacionar dicha emisión medida procedente de dicho grupo emisor de luz con la presencia de dicho complejo de hibridación diana como función de la temperatura, determinando de esta manera la Tm de dicho complejo de hibridación diana basándose en dicha emisión medida. 2. Método según la reivindicación 1, en el que proporcionar una diana de hibridación comprende producir un amplicón correspondiente a un ácido nucleico diana. 3. Método según la reivindicación 1, en el que dicha producción de un amplicón comprende amplificar un ácido nucleico diana mediante una reacción en cadena de polimerasa, preferentemente mediante una reacción en cadena asimétrica de polimerasa. 4. Método según la reivindicación 1, en el que dicho modificador soluble de la emisión lumínica comprende un pigmento seleccionado de entre azul de metileno, verde de metileno, tionina, dimetiltionina-sim, azul de toluidina O, azul de metileno nuevo, violeta de metileno Bernthsen, azur A, azur B, azur C, azul 1,9-dimetilmetileno, un pigmento azocarmín, un pigmento fenacina, un pigmento oxacina y cloruro de dietilsafraninazodimetilanilina. 5. Método según la reivindicación 1, en el que dicha etapa de medición comprende medir la emisión en un intervalo de temperaturas, preferentemente entre 20ºC y 95ºC. 6. Método para producir un ácido nucleico dúplex estabilizado, comprendiendo el método: (a) proporcionar: (i) una muestra que contiene o que se sospecha que contiene una molécula diana de ácidos nucleicos, (ii) un oligonucleótido complementario, o parcialmente complementario, a dicha molécula diana de ácidos nucleicos, y (iii) por lo menos un pigmento tiazina soluble presente a una concentración efectiva para estabilizar un dúplex formado entre dicha molécula diana de ácidos nucleicos y dicho oligonucleótido, y (b) uno de entre: ES 2 365 893 T3 (i) hibridar dicho ácido nucleico diana y dicho oligonucleótido en presencia de dicho pigmento tiazina soluble, o (ii) hibridar dicho ácido nucleico diana y dicho oligonucleótido, seguido de la mezcla con dicho pigmento tiazina soluble, bajo condiciones en las que se produce el apareamiento de bases, produciendo por lo menos un ácido nucleico dúplex estabilizado. 7. Método según la reivindicación 6, en el que la estabilidad de dicho ácido nucleico dúplex de (b) se ha mejorado en comparación con la estabilidad de un ácido nucleico dúplex que comprende dicho ácido nucleico diana y dicho oligonucleótido en ausencia de dicho pigmento tiazina o de una concentración reducida de dicho pigmento tiazina, y en el que dicha estabilidad de dichos ácidos nucleicos dúplex en presencia y en ausencia o con una concentración reducida de dicho pigmento tiazina se mide a partir de: (i) una temperatura de fusión (Tm), (ii) una determinación de la CT, o (iii) un ensayo de 5'-nucleasa. 8. Método según la reivindicación 7, en el que el oligonucleótido y el pigmento diazina y/o el pigmento tiazina se ponen en contacto en una mezcla de reacción que no presenta sustancialmente bromuro de etidio. 76 9. Método según la reivindicación 6, en el que dicho ácido nucleico dúplex estabilizado comprende uno o más desapareamientos de nucleobase. 10. Método según la reivindicación 6, en el que proporcionar dicha molécula diana de ácidos nucleicos y dicho oligonucleótido comprende proporcionar por lo menos dos moléculas de ácidos nucleicos, y dicha molécula diana de ácidos nucleicos y dicho oligonucleótido residen en moléculas de ácidos nucleicos diferentes. 11. Método según la reivindicación 6, que comprende además un segundo oligonucleótido complementario, o parcialmente complementario, a dicha molécula diana de ácidos nucleicos, resultando efectivo cada uno de dichos oligonucleótidos para el cebado de una reacción de extensión de ácidos nucleicos en el caso de encontrarse apareado con dicho ácido nucleico diana. 12. Método según la reivindicación 6, en el que dicho pigmento tiazina se selecciona de entre azul de metileno, verde de metileno, tionina, dimetiltionina-sim, azul de toluidina O, azul de metileno nuevo, violeta de metileno Bernthsen, azur A, azur B, azur C y azul 1,9-dimetilmetileno, y en el que dicha hibridación comprende la hibridación en presencia de un pigmento tiazina a una concentración de entre aproximadamente 10 µg/ml y 50 µg/ml, preferentemente de entre aproximadamente 10 µg/ml y 40 µg/ml. 13. Kit para determinar la temperatura de fusión (Tm) de un complejo de hibridación, comprendiendo el kit: (a) por lo menos una sonda que comprende un grupo emisor de luz, en el que dicha sonda es complementaria, o parcialmente complementaria, a una diana de hibridación, (b) por lo menos un modificador soluble de la emisión lumínica que comprende un pigmento tiazina soluble o un pigmento diazina, en el que dicho modificador soluble de la emisión lumínica es capaz de desactivar dicho grupo emisor de luz, y (c) uno o más recipientes que comprenden (a), (b), o (a) y (b). 14. Kit según la reivindicación 13, que comprende uno o más componentes adicionales seleccionados de entre una transcriptasa inversa, por lo menos un cebador adecuado para el inicio de la actividad de transcriptasa inversa a partir de un ácido nucleico diana, una ADN polimerasa termoestable dependiente de ADN, desoxirribonucleótidos trifosfato libres, muestras para estandarización, muestras de control positivo, muestras de control negativo, tampones adecuados para reacciones enzimáticas, tubos de recolección de muestras y tubos para reacciones de amplificación. 15. Sistema para determinar una temperatura de fusión (Tm) de un complejo de hibridación, comprendiendo el sistema: (a) una muestra que comprende: ES 2 365 893 T3 (i) una sonda de ácidos nucleicos que comprende un grupo emisor de luz que emite una señal, (ii) un ácido nucleico diana que es complementario, o parcialmente complementario, a dicha sonda de ácidos nucleicos, y (iii) un pigmento tiazina soluble o un pigmento diazina soluble, (b) un dispositivo de control térmico para regular la temperatura de la muestra en un intervalo de temperaturas, en el que dicho intervalo incluye: (i) una temperatura a la que esencialmente la totalidad de las moléculas de sonda se hibridan con dicha sonda de hibridación bajo un conjunto determinado de condiciones de hibridación, (ii) una temperatura a la que 50% de dichos complejos diana de hibridación se disocian bajo dichas condiciones de hibridación, y (ii) una temperatura a la que esencialmente ninguna molécula de sonda se hibrida con dicha diana de hibridación y esencialmente no se encuentra presente ningún complejo de hibridación bajo dichas condiciones de hibridación, (c) un detector para medir dicha señal de dicha muestra en dicho intervalo de temperaturas, y (d) un módulo de correlación que se encuentra operablemente acolado al detector y recibe mediciones de señal en dicho intervalo de temperaturas, en el que el módulo de correlación correlaciona la intensidad de la señal con la presencia de un complejo de hibridación que comprende dicha sonda y dicha diana de hibridación mezclados con dicho pigmento tiazina o pigmento diazina como función de la temperatura, determinando de esta manera la Tm de dicho complejo de hibridación diana. 77 ES 2 365 893 T3 78 ES 2 365 893 T3 79 ES 2 365 893 T3 ES 2 365 893 T3 81 ES 2 365 893 T3 82 ES 2 365 893 T3 83 ES 2 365 893 T3 84 ES 2 365 893 T3 ES 2 365 893 T3 86 ES 2 365 893 T3 87 ES 2 365 893 T3 88 ES 2 365 893 T3 89 ES 2 365 893 T3 ES 2 365 893 T3 91 ES 2 365 893 T3 92 ES 2 365 893 T3 93 ES 2 365 893 T3 94 ES 2 365 893 T3 ES 2 365 893 T3 96 ES 2 365 893 T3 97 ES 2 365 893 T3 98 ES 2 365 893 T3 99 ES 2 365 893 T3 ES 2 365 893 T3 101 ES 2 365 893 T3 102 ES 2 365 893 T3 103 ES 2 365 893 T3 104 ES 2 365 893 T3 ES 2 365 893 T3 106 ES 2 365 893 T3 107 ES 2 365 893 T3 108 ES 2 365 893 T3 109 ES 2 365 893 T3 ES 2 365 893 T3 111 ES 2 365 893 T3 112 ES 2 365 893 T3 113