DISPOSITIVO DE MICROFLUIDO PARA ESTUDIO DE CÉLULAS.

Un dispositivo (46) para el estudio de células, que lleva hoyuelos,

depresiones, tubos, o inclusiones de un tamaño que se acomodan a una o más células como picopozos, por medio de los cuales los picopozos tienen una dimensión de 1 a 200μm, Que comprende a) un portador (50) que tiene una superficie superior (48). b) Un arreglo de picopozo (18) sobre la superficie superior (48), c) Un reservorio de fluido (52) en comunicación fluida con el arreglo de picopozo (18) a través de al menos un cal capilar (54) y d) Una tapa (60) es movible con relación dicho portador (50) y Configurada para descansar por encima de dicho arreglo de picopozo (18), donde Dicho portador (50) es un componente unitario que tiene un arreglo en el picopozo (18), un reservorio de fluido (52), un canal capilar (54) como un reservorio de desperdicio (56), y un canal capilar de desperdicio (58), y una depresión (78) integralmente conformadas sobre este, por un arreglo de picopozo (18), parte de un componente que lleva un picopozo separado (93), donde dicho canal de desperdicio capilar (58) está en comunicación fluida con dicho arreglo de picopozo (18) y que comprende una meseta (47) sobre dicha superficie superior (48), en donde dicho arreglo ético (18) se localiza sobre dicha meseta (47) o en un depresión (78), en dicha meseta (47) donde una primera región de dicha meseta (47) constituye una parte de dicho canal capilar (54) y una segunda región de dicha meseta (47) constituye una parte de dicho canal capilar de desperdicio (58)

Campo y Antecedentes de la Invención

La presente invención se relaciona con el campo de la biología celular y más particularmente, con un dispositivo y método mejorado para estudio de células. Específicamente la presente invención es de un dispositivo que incluye un arreglo de picopozo y conductos de fluido capilares.

Los métodos combinatorios en química, biología celular y bioquímica son esenciales para la preparación simultánea cercana de multitudes de entidades activas tales como moléculas. Una vez se prepara tal multitud de moléculas, es necesario estudiar el efecto de cada una de las entidades activas sobre un organismo vivo.

El estudio de los efectos de estímulos tal como la exposición a entidades activas sobre organismos vivos es preferiblemente de manera inicial efectuada en células vivas. En razón a que las funciones de la célula incluyen muchas células interrelacionadas, los ciclos y las reacciones químicas, el estudio de un agregado de células, sea un agregado homogéneo o heterogéneo no suministra unos resultados suficientemente detallados o interpretables: en su lugar un estudio comprensivo de la actividad biológica de una entidad activa puede ser efectuado de manera ventajosa al examinar el efecto de la entidad activa sobre las células vivas aisladas simples. Así, el uso de ensayos de células simples es una de las herramientas más importantes para entender los sistemas biológicos y la influencia sobre estas de varios estímulos tales como la exposición a entidades activas.

La preparación combinatoria de multitudes de entidades activas acopladas con la necesidad de estudiar el efecto de cada una de las entidades activas sobre los organismos vivos que utilizan ensayos de célula simple, requieren el desarrollo de ensayos de célula viva simple de alto rendimiento. Existe necesidad de estudio de respuestas en tiempo real a los estímulos en poblaciones de células grandes y heterogéneas a un nivel de célula individual. En tales estudios es esencial tener la capacidad de definir características múltiples de cada célula individual, así como también la respuesta de la célula individual a los estímulos experimentales de interés.

En la técnica, se conocen varios diferentes métodos para estudiar las células vivas.

Las placas multipozos que tienen 6, 12, 48, 96, 384 o aún 1536 pozos sobre una huella de ca. 8,5 cm por ca. 12,5 cm son bien conocidos en la técnica. Tales placas multipozo se suministran con un arreglo 2n por 3n de pozos empacados rectangulares, siendo un entero. El diámetro de los pozos de una placa depende del número de pozos y es generalmente mayor de aproximadamente 250 micrómetros (para una placa de 1536 pozos). El volumen de los pozos depende del número de los pozos y la profundidad del mismo pero generalmente es mayor de 5 x 10-6 litros (para una placa de 1536 pozos). La estandarización del formato de placa multipozo es una gran ventaja para los investigadores, que permiten el uso de productos estandarizados que incluyen dispositivos de manejo robótico, manejadores de muestras automatizadas, dispensadores de muestra, lectores de placa, componentes de observación, lavadores de placa, software y accesorios tales como multifiltros.

Las placas multipozo están comercialmente disponibles en muchos diferentes abastecedores. Las placas multipozo hechas de muchos diferentes materiales están disponibles, incluyendo pero no estando limitado a vidrio, plásticos, cuarzo y silicio. Las placas multipozo que tienen pozos donde la superficie interna está recubierta con varios materiales, tales como entidades activas son conocidas.

Aunque excepcionalmente útiles para el estudio de grandes grupos de células, las placas multipozo no son adecuadas para el estudio de células individuales a unos pequeños grupos de células debido al tamaño grande relativo a la escala celular, de los pozos. Las células mantenidas en tales pozos flotan alrededor de una solución o se adhieren a la superficie del pozo. Cuando las células flotan en un pozo, las células individuales específicas no son fácilmente encontradas para observación. Cuando las células se adhieren a la superficie del pozo, las células se adhieren a cualquier localización en el pozo, incluyendo cualquier parte sobre el fondo y las paredes del pozo. Tal variabilidad en la localización hace imágenes de alto rendimiento (por ejemplo para estudios morfológicos) que se inoculan como adquiriendo una célula individual y enfocarse sobre esta es extremadamente difícil. Ta variabilidad en la localización también hace un procesamiento de señal de alto rendimiento (por ejemplo, detección de luz emitida por una célula única o simple a través de procesos fluorescentes) que se inoculan a medida en que luz se debe recoger del área entera del pozo, disminuyendo la señal a un índice de ruido. Además, una célula mantenida en un pozo de placa multipozo puede ser física o químicamente manipulada (por ejemplo aislamiento o movimiento de una célula seleccionada única o un tipo único de célula, que cambia el medio o que introduce entidades activas) solo con dificultad. Además, la carga de las placas multipozo cuando se localizan sobre una célula por pozo, expresada en términos de células mantenidas de manera única en los pozos por unidad de área es muy baja (aproximadamente 1536 células en 65 cm2, o 24 células cm-2). Así, las placas multipozos son en general solo adecuadas para el estudio de agregados homogéneos o heterogéneos de células como un grupo.

Las placas multipozo son inadecuadas para el estudio de la apoptosis que sufren las células. Es conocido estudiar procesos biológicos al exponer una monocapa de células que se adhieren al fondo del pozo de una placa multipozo a un estimulo que origina la apoptosis. Sin embargo, una vez que la célula inicia con el proceso de apoptosis, la adhesión de la célula al fondo del pozo ya no es suficiente: la célula se separa del fondo y es llevada por corrientes de fluido incidental en el pozo. La célula ya no es observable y su identidad se pierde.

Las placas multipozo también son inadecuadas para el estudio de células no adherentes. Solo justo como células que sufren apoptosis, en placas multipozo las células que no se adhieren se pueden estudiar como individuos solo con dificultad. Esta es la principal desventaja en razón a que las células que no se adhieren son cruciales para investigar el descubrimiento de fármacos, terapias de célula madres, cáncer y detección de enfermedades inmunológicas, diagnostico y terapia. Por ejemplo, la sangre contiene 7 tipos heterogéneos de células no adherentes, todas las cuales efectúan funciones esenciales, desde llevar oxigeno a suministrar inmunidad contra una enfermedad.

En la técnica, un número de métodos y dispositivos se han desarrollado para el estudio de células individuales o un pequeño número de células, un grupo. Muchos de tales métodos son o están basados en utilizar un dispositivo que lleva picopozo. El dispositivo que lleva picopozo es un dispositivo para el estudio de células que tiene al menos un componente que lleva picopozo para el estudio9 de células. Un componente que lleva picopozo es un componente que tiene al menos una pero generalmente una pluralidad de picopozos, cada picopozo configurado para mantener al menos una célula. El término “picopozo” es general e incluye características tales como encrespaduras, depresiones, tubos e inclusiones. En razón a que el rango de células en tamaño desde aproximadamente 1 micrómetro a aproximadamente 100 (o aún más) micrómetros de diámetro no existe un tamaño de picopozo único que sea apropiado para mantener una célula única de cualquier tipo. Dicho eso, las dimensiones del picopozo individual típico en los componentes que llevan picopozo conocidos en la técnica tienen invenciones de entre aproximadamente 1 micrómetro a aproximadamente 200 micrómetros, dependiendo de la implementación exacta. Por ejemplo, un dispositivo diseñado para el estudio de células de 20 micrones aislados únicas típicamente tienen picopozos de dimensiones de aproximadamente 20 micrómetros. En otros casos, se utilizan picopozos mayores para estudiar la interacción de unas pocas células mantenidas juntas en un picopozo. Por ejemplo, un picopozo de 200 micrómetros se reconoce al ser utilizado para el estudio de interacciones de 2 o 3 células, ver Solicitud de Patente PCT No. IL01/00992 Publicada como WO03/035824.

Una característica que incrementa la utilidad del dispositivo que lleva picopozo es que cada picopozo individual es individualmente...

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

Un dispositivo (46) para el estudio de células, que lleva hoyuelos, depresiones, tubos, o inclusiones de un tamaño que se acomodan a una o más células como picopozos, por medio de los cuales los picopozos tienen una dimensión de 1 a 200µm, Que comprende a) un portador (50) que tiene una superficie superior (48). b) Un arreglo de picopozo (18) sobre la superficie superior (48), c) Un reservorio de fluido (52) en comunicación fluida con el arreglo de picopozo (18) a través de al menos un cal capilar (54) y d) Una tapa (60) es movible con relación dicho portador (50) y Configurada para descansar por encima de dicho arreglo de picopozo (18), donde Dicho portador (50) es un componente unitario que tiene un arreglo en el picopozo (18), un reservorio de fluido (52), un canal capilar (54) como un reservorio de desperdicio (56), y un canal capilar de desperdicio (58), y una depresión (78) integralmente conformadas sobre este, por un arreglo de picopozo (18), parte de un componente que lleva un picopozo separado (93), donde dicho canal de desperdicio capilar (58) está en comunicación fluida con dicho arreglo de picopozo (18) y que comprende una meseta (47) sobre dicha superficie superior (48), en donde dicho arreglo ético (18) se localiza sobre dicha meseta (47) o en un depresión (78), en dicha meseta (47) donde una primera región de dicha meseta (47) constituye una parte de dicho canal capilar (54) y una segunda región de dicha meseta (47) constituye una parte de dicho canal capilar de desperdicio (58).

El dispositivo de la reivindicación 1, en donde dicha tapa (60) es movible sustancialmente y en paralelo con dicha superficie superior (48).

Los dispositivos de la reivindicación 1, en donde dicho reservorio de fluido (52) se localiza sobre dichas superficies superior (48). El dispositivo de la reivindicación 1, en donde dicha tapa (60) es un componente de dicho reservorio de fluido (52). El dispositivo de la reivindicación 1, en donde dicha tapa (60) se asocia deslizantemente con dicho portador (50) El dispositivo de la reivindicación 1, en donde dicha tapa (60) se suministra con una característica configurada para acoplar un dispositivo que se aplicaba a la fuerza utilizado para mover dicha tapa (60) con relación a dicho portador (50). El dispositivo de la reivindicación 1, en donde dicha tapa (60) tiene al menos dos posiciones de descanso sustancialmente diferentes con relación a dicho arreglo de picopozo (18). El dispositivo de la reivindicación 1, en donde dicho portador (50) comprende además dos rieles, en donde dicho arreglo de picopozo (18) se localiza entre dichos do rieles (64) y en donde dicha tapa (60) se asocia deslizantemente con dichos dos rieles (64). El dispositivo de la reivindicación 8, en donde dicho arreglo de picopozo (18) se localiza en una depresión (78) entre dichos dos rieles (64). El dispositivo de la reivindicación 9, en donde dicha tapa (60) y un área entre dicho dos rieles (64) definen sustancialmente un canal capilar (54,58). El dispositivo de la reivindicación 1, en donde una meseta (47) sobre la superficie superior

(48) constituye una parte del canal de desperdicio capilar (58) y donde el canal de desperdicio de capilar (58) se define por el espacio entre la tapa (60) y la meseta (47).