Un dispositivo microfluídico para la determinación del tiempo de coagulación en un medio fluido tal como sangre o plasma,

comprendiendo dicho dispositivo: - medios (1) para introducir una muestra de dicho medio fluido; acoplados a un canal capilar de distribución (2) y - una primera región (6a), acoplada a dichos medios (1) para introducir una muestra, para permitir que dicho medio fluido fluya a lo largo de la longitud de dicha primera región; - una primera zona (5a) al comienzo de dicha primera región conteniendo un reactivo que puede reaccionar con dicho medio fluido; - una segunda región (6b), también acoplada con dichos medios (1) para introducir una muestra, para permitir que dicho medio fluido fluya a lo largo de una longitud de dicha segunda región; - en el que dicha segunda región (6b) no contiene un reactivo que puede reaccionar con dicho medio fluido o - en el que existe una segunda zona (5b), al comienzo de dicha segunda región (6b) que contiene un reactivo que puede reaccionar con dicho medio fluido, que es diferente del reactivo de la primera zona (5a); caracterizado porque cada una de dichas regiones (6a) y (6b) comprende, en orden desde el canal de distribución (2), en primer lugar las zonas (5a) y (5b) y al menos un canal microfluídico que es la zona de barrido (8)

Dispositivo microfluídico y procedimiento para la determinación del tiempo de coagulación de un fluido

Campo de invención

La presente invención se refiere a un dispositivo del tipo “laboratorio en un chip” y al procedimiento para la determinación del tiempo de coagulación, en particular para la determinación del tiempo de coagulación de sangre. También se refiere a un dispositivo de medida, como un coagulómetro, a utilizar en combinación con el “laboratorio en un chip” de la invención.

Antecedentes de la invención

En las personas sanas, la viscosidad y espesor de la sangre se regulan por un proceso conocido como hemostasia. Este mecanismo evita la pérdida de sangre del sistema vascular.

La coagulación sanguínea está regulada por un proceso complejo capaz de detener cualquier sangrado que se produzca en el cuerpo. La formación de coágulos estables se realiza por la interacción de los factores proteínicos de coagulación, los capilares sanguíneos y las plaquetas. Los procesos continúan después de la cicatrización cuando el coágulo se disuelve.

Durante las primeras etapas de la formación de coágulos se agregan las plaquetas, al mismo tiempo en el que se inicia el fenómeno conocido como cascada de coagulación. En este proceso, el fibrinógeno, una proteína soluble en el plasma sanguíneo, se convierte en una red de fibrina insoluble o coágulo sanguíneo. Esta transformación se cataliza por la trombina, una enzima generalmente presente en la sangre en su forma inactiva, la protrombina.

Los desequilibrios en la hemostasia ocasionan alteraciones sanguíneas. Estos pueden ser de origen genético, tales como la hemofilia o la enfermedad de Von Willebrand; desencadenada por otras dolencias tales como el síndrome de anticuerpos antifosfolípidos, síndrome de intestino irritable o cáncer; o adquiridos por factores extrínsecos: pacientes que toman anticoagulantes orales como tratamiento o profilaxis de alteraciones trombóticas, cardiopatías

o vasculopatías.

La terapia con anticoagulantes orales, como warfarina, es de amplio uso y necesita vigilancia frecuente debido a su bajo índice terapéutico. La dosificación debe ajustarse periódicamente para evitar la trombosis o el riesgo de hemorragia.

Para estos y otros pacientes en condiciones de predisposición conocidas tales como inmovilidad, obesidad, avenencia o aquellos en tratamiento dental o quirúrgico, la disponibilidad de pruebas fiables que les permita vigilar regularmente la coagulación en sus domicilios representaría una alternativa conveniente, rápida y barata frente a los ensayos de coagulación clínicos actualmente disponibles. Tales ensayos también pueden ser empleados como una ayuda preliminar en el diagnóstico de trastornos hemostáticos.

El ensayo de coagulación más habitual en el mundo es el denominado Relación Internacional Normalizada (INR). Esta relación se calcula a través del tiempo de protrombina (PT), que es el tiempo transcurrido desde la activación mediante un agente de coagulación hasta el comienzo de la coagulación sanguínea. El agente coagulante es un factor tisular o tromboplastina y este mecanismo se denomina la vía “extrínseca” de coagulación. Debido a las diferencias entre distintos lotes y fabricantes de factor tisular (es un producto de origen biológico), se estableció el INR como medio para normalizar los resultados. El INR es el cociente entre el tiempo de protrombina de un paciente respecto al tiempo de protrombina promedio (MNPT) de al menos 20 personas sanas, elevado a la potencia del valor del Índice internacional de sensibilidad (ISI) de la muestra de control utilizada. Cada fabricante proporciona un ISI de cualquier factor tisular comercializado, indicando la manera en que un lote concreto de factor tisular debe compararse con una muestra normalizada internacionalmente.

Hay un segundo tipo de análisis, pero menos comúnmente utilizado, consistente en un mecanismo de coagulación análogo, a través de la vía “intrínseca”, y que se denomina Tiempo de protrombina parcial activada (APTT). Estos dos análisis se denominan como tiempos de coagulación en la presente solicitud.

Tradicionalmente, en Europa, estos análisis han sido realizados en los laboratorios, donde se requiere, generalmente, una preparación de la muestra de sangre antes de la determinación del PT. En los últimos años hay una tendencia emergente respecto a la utilización de los dispositivos POC (lugar de atención sanitaria) o similarmente denominados “pruebas cerca del paciente” (NPT) para ser usados directamente por el médico o la enfermera, o autónomamente por el paciente. Estos procedimientos están sustituyendo ampliamente a los tradicionales.

Los procedimientos desarrollados inicialmente y conocidos en el estado de la técnica requieren la extracción de grandes cantidades de sangre o volúmenes conocidos mediante venopunción, tratamiento posterior de la sangre previo a la realización de la analítica y de personal experto para la realización de los procesos y la interpretación de los resultados. En contraposición, los coagulómetros del lugar de atención sanitaria, denominados también coagulómetros portátiles, solo requieren una gota de sangre completa extraída por punción en el dedo y proporcionan el resultado de INR de forma inmediata.

La solicitud de patente WO 92/21028 describe un procedimiento de detección basado en el ferromagnetismo. El dispositivo consta de una cámara de coagulación y una cámara de control, cada una de las cuales está acoplada a una paleta de agitación que gira en un campo magnético oscilante. El movimiento de la paleta en la cámara de coagulación se ralentiza a medida que comienza la coagulación sanguínea y ejerce resistencia contra su movimiento. El tiempo de coagulación se determina cuando cambia el movimiento relativo de las paletas de agitación en las cámaras.

Otros dispositivos, tales como los que aparecen en la patente US 5110727 contienen una muestra de sangre con partículas metálicas dispersadas en ella. Cuando se aplica un campo magnético oscilante se induce un movimiento de ir y venir que se ralentiza a medida que la sangre coagula. La disminución en la velocidad se correlaciona con el incremento de la viscosidad en la muestra de sangre o el comienzo de la coagulación.

Las solicitudes de patente WO 00/06761 y WO 02/48707 A2 describen dispositivos equipados con electrodos en contacto con una muestra sanguínea estacionaria y miden, respectivamente, la variación en la conductividad eléctrica y la variación en la corriente a medida que se incrementa la viscosidad de la sangre.

WO 2004/059316 A1 describe un dispositivo de bajo coste y desechable para la determinación del tiempo de coagulación de la sangre. El dispositivo está equipado con un microsensor, al menos parcialmente en contacto con el fluido y mide la impedancia y la capacitancia de la sangre en el canal donde la sangre coagula y el flujo se para.

Sin embargo, los altos costes de producción asociados con dicho dispositivo restringen su uso como elemento desechable.

De este modo, permanece la necesidad de un chip desechable, preciso y de bajo coste y de un procedimiento de detección para las analíticas de coagulación sanguínea para los POC y/o NPT.

Se ha producido un desarrollo en la dirección de pruebas analíticas de tamaños menores, que requieren muestras de sangre completa menores y sin cuantificar, en la escala del microlitro, gracias a los avances en la ciencia de los materiales y los procedimientos electrónicos y ópticos.

La solicitud de patente WO 2007/025559 A1 revela un dispositivo multicapa para la determinación de la coagulación en una muestra de plasma o de sangre entera, que contiene una o más áreas de detección, todas ellas equipadas con al menos un reactivo de estimulación de la coagulación.

La solicitud de patente US2007/0122849A1 revela una estructura para análisis de una muestra en un chip microfluídico para el análisis cuantitativo y la detección de los analitos.

El documento EP 0394070 B1 describe un dispositivo microfluídico de un canal capilar, optimizado para la determinación del APTT en una muestra de sangre entera, con un volumen de 40μl y un tiempo de residencia de 200s. El dispositivo utiliza como reactivo una mezcla de un agente activante para la determinación del APTT y una mezcla de fosfolípidos. El procedimiento... [Seguir leyendo]

1. Un dispositivo microfluídico para la determinación del tiempo de coagulación en un medio fluido tal como sangre o plasma, comprendiendo dicho dispositivo:

- medios (1) para introducir una muestra de dicho medio fluido; acoplados a un canal capilar de distribución (2) y -una primera región (6a), acoplada a dichos medios (1) para introducir una muestra, para permitir que dicho medio fluido fluya a lo largo de la longitud de dicha primera región; -una primera zona (5a) al comienzo de dicha primera región conteniendo un reactivo que puede reaccionar con dicho medio fluido; -una segunda región (6b), también acoplada con dichos medios (1) para introducir una muestra, para permitir que dicho medio fluido fluya a lo largo de una longitud de dicha segunda región; -en el que dicha segunda región (6b) no contiene un reactivo que puede reaccionar con dicho medio fluido o -en el que existe una segunda zona (5b), al comienzo de dicha segunda región (6b) que contiene un reactivo que puede reaccionar con dicho medio fluido, que es diferente del reactivo de la primera zona (5a); caracterizado porque cada una de dichas regiones (6a) y (6b) comprende, en orden desde el canal de distribución (2), en primer lugar las zonas (5a) y (5b) y al menos un canal microfluídico que es la zona de barrido (8).

2. Un dispositivo microfluídico de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque cada una de dichas regiones (6a, 6b) consiste en al menos un canal microfluídico.

3. Un dispositivo microfluídico de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado porque dichos canales microfluídicos (6a, 6b) son canales capilares, en el que las superficies de dichos canales son hidrófilas y la capilaridad actúa como la única fuerza para mover el medio fluido.

4. Un dispositivo microfluídico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque cada una de dichas regiones contiene medios (7) de ventilación.

5. Un dispositivo microfluídico de acuerdo con la reivindicación 4, consistiendo dichos medios de ventilación en un puerto de ventilación (7) que funciona como una válvula de retención de flujo.

6. Un dispositivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque dicha primera zona de dicha primera región consiste en una celda de reacción (5a) que contiene un reactivo que puede iniciar la coagulación de dicho medio fluido.

7. Un dispositivo microfluídico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque dicha segunda zona de dicha segunda región consiste en una celda de reacción (5b) que contiene un reactivo que puede inhibir la coagulación de dicho medio fluido.

8. Un dispositivo microfluídico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizado porque dicho dispositivo comprende además una tercera región, también acoplada con dichos medios (1) para introducir una muestra, para permitir que dicho medio fluido fluya a lo largo de una longitud de dicha tercera región, en el que al comienzo de dicha tercera región existe una tercera zona que contiene un reactivo que puede reaccionar con dicho medio fluido que es diferente del reactivo de la primera (5a) o segunda (5b) zona.

9. Un dispositivo microfluídico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque dichos medios para introducir una muestra consisten en un puerto de entrada (1) acoplado con dichas regiones primera y segunda (6a, 6b), y con la tercera región si está presente, por medio de un canal de distribución

(2) seguido por una bifurcación de canal (3) que divide (4) en dichas regiones primera, segunda y tercera opcional.

10. Un dispositivo microfluídico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque dichas regiones primera, segunda y tercera opcional (6a, 6b) tienen una forma curvada.

11. Un dispositivo microfluídico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque dichas regiones primera, segunda y tercera opcional (6a, 6b) consisten en canales que tienen una trayectoria en forma serpenteante.

12. Un dispositivo microfluídico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque los canales tienen una sección transversal rectangular.

13. Un dispositivo microfluídico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque los canales consisten en una combinación de segmentos de diferentes secciones transversales.

14. Un dispositivo microfluídico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque dicho reactivo en la zona (5a) es tromboplastina y dicho tiempo de coagulación representa el tiempo de protrombina.

15. Un dispositivo microfluídico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque dicha primera región actúa como un canal de coagulación (6a) y dicha segunda región actúa como un canal de control (6b) y porque cada una de las dos regiones tiene una estructura idéntica.

16. Un dispositivo microfluídico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque dicha primera región actúa como un canal de coagulación (6a) y dichas regiones segunda y tercera actúan como canales de control, y porque cada una de las tres regiones tiene una estructura idéntica.

17. Un dispositivo microfluídico de acuerdo con las reivindicaciones 1-16, que comprende además características ópticas para el control de calidad.

18. Un dispositivo coagulómetro que comprende:

- una ranura para introducir un dispositivo microfluídico de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 17; -medios ópticos para detectar y/o monitorizar de manera continua la posición del frente de dicho medio fluido en cada una de dichas regiones y/o su velocidad; y -medios para procesar los datos entregados por dichos medios de detección y/o monitorización y para la determinación del tiempo de coagulación de dicho medio fluido, en el que los medios ópticos también miden o leen las características de control de calidad en el dispositivo microfluídico.

19. Un dispositivo coagulómetro de acuerdo con la reivindicación 18, caracterizado porque dichos medios de procesamiento incluyen medios para comparar dicha propiedad o propiedades en cada una de las dos o tres regiones.

20. Un dispositivo coagulómetro de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 19, caracterizado porque dichos medios de procesamiento incluyen medios para detectar el punto en el tiempo en el que la diferencia entre dicha propiedad o propiedades en el primer canal (6a) y dicha propiedad o propiedades en el segundo canal (6b) y/o tercer canal alcanza un umbral predeterminado.

21. Un dispositivo coagulómetro de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, caracterizado porque dichos medios de detección y/o monitorización incluyen medios para iluminar cada una de dichas regiones y medios para analizar la luz trasmitida o reflejada por cada una de dichas regiones.

22. Un dispositivo coagulómetro de acuerdo con la reivindicación 21, caracterizado porque dichos medios de iluminación comprenden al menos un LED y dichos medios de análisis comprenden al menos un sensor óptico.

23. Un dispositivo coagulómetro de acuerdo con la reivindicación 22, caracterizado porque dichos medios de análisis incluyen al menos una lente.

24. Un procedimiento para la determinación del tiempo de coagulación en un medio fluido tal como sangre

o plasma que comprende las siguientes etapas:

- introducir una muestra de dicho medio fluido en un dispositivo microfluídico de acuerdo con las reivindicaciones 1-17 que tiene las regiones primera y segunda (6a, 6b) en el que se le permite fluir a lo largo de una longitud; -proporcionar al comienzo de dicha primera región (6a) en la zona (5a) un primer reactivo (5a) que puede reaccionar con dicho medio fluido; y -no proporcionar en dicha segunda región (6b) en la zona (5b) ningún reactivo o bien proporcionar un segundo reactivo (5b) diferente del primer reactivo (5a) en dicha primera región (6a), -monitorizar de manera continua con medios ópticos al menos una propiedad de dicho medio fluido en dicha primera región (6a) y dicha segunda región (6b), -comparar al menos una propiedad de dicho medio fluido en dicha primera región (6a) con al menos la misma propiedad de dicho medio fluido en dicha segunda región (6b) o con un valor teórico de esta propiedad.

25. Un procedimiento para la determinación del tiempo de coagulación en un medio fluido tal como sangre

o plasma de acuerdo con la reivindicación 24, caracterizado porque la comparación de al menos dicha propiedad de dicho medio fluido en dicha primera región se realiza con al menos una propiedad de dicho medio fluido en dicha segunda región (6b).

26. Un procedimiento para la determinación del tiempo de coagulación en un medio fluido tal como sangre o plasma de acuerdo con la reivindicación 24, caracterizado porque la comparación de al menos dicha propiedad de dicho medio fluido en dicha primera región se realiza con un valor teórico para dicha propiedad.

27. Un procedimiento para la determinación del tiempo de coagulación en un medio fluido tal como sangre o plasma de acuerdo con la reivindicación 24 o 25, caracterizado porque el procedimiento incluye una etapa de control de calidad que comprende correlacionar dichas propiedades monitorizadas con las curvas teóricas.

28. Un procedimiento de fabricación de un dispositivo microfluídico de acuerdo con cualquiera de las

reivindicaciones 1-17, para la determinación del tiempo de coagulación en un medio fluido tal como sangre o plasma 10 que comprende las siguientes etapas:

- proporcionar un primer sustrato; -estampar en dicho primer sustrato una microestructura que corresponde a un dispositivo microfluídico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17; -proporcionar un segundo sustrato; y -sellar dicho segundo sustrato en la parte superior de dicho primer sustrato estampado, de modo que dicho segundo sustrato actúa como una tapa de cubierta.

29. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 28, en el que dicho segundo sustrato es una 20 película hidrófila.