Método y sistema de medida del tiempo de vida de fluorescencia en el dominio de la frecuencia con altos niveles de señal de fondo.

La medida del tiempo de vida medio de la emisión fluorescente en el dominio de la frecuencia se ve dificultada por la presencia de señales de fondo. Se propone un método y un aparato pan detectar dicho tiempo de vida incluso cuando la fluorescencia es mucho menor que el fondo, sin necesidad de una muestra de calibración, basado en una exploración sucesiva de estados en el sistema. Lo característico de estos estados es que la señal de fondo se mantiene constante, mientras que la señal de interés cambia. La señal de interés se podrá recuperar realizando una cancelación de la señal común. Esta técnica se puede utilizar para eliminar el efecto de la luz dispersada de excitación, de la autofluorescencia, y de la interferencia electromagnética

Método de medida del tiempo de vida de fluorescencia en el dominio de la frecuencia con altos niveles de señal de fondo.

Sector técnico

La invención se encuadra en el sector de la química analítica. La detección del tiempo de vida de sustancias fluorescentes encuentra aplicación en diferentes sectores como los análisis clínicos, la detección de contaminantes en agua, procesos de control en la industria alimentaria, la medida de diversas magnitudes ambientales, etc.

Antecedentes de la invención

Dado que la técnica de la medida del tiempo de vida de la fluorescencia en el dominio de la frecuencia se conoce y se utiliza desde hace varias décadas, está profundamente documentada en una gran cantidad de textos, artículos y patentes. Una excelente explicación de la técnica en sí, sus principios, su evolución histórica, y los avances recientes se puede encontrar en el libro "Principies of Fluorescence Spectroscopy", de Joseph R. Lakowicz, ed. Springer, Cap. 5.

Una gran cantidad de sustancias presenta emisión fluorescente y/o fosforescente. De aquí en adelante se empleará el término fluorescencia aunque todo lo dicho es aplicable también a la fosforescencia o cualquier otro tipo de fotoluminiscencia. Típicamente, al iluminar con luz de determinada longitud de onda dentro del rango de absorción de la sustancia, la fluorescencia puede ser observada como una emisión de luz en un rango de longitudes de onda mayores que las de la señal de excitación. Este fenómeno se puede caracterizar con diferentes magnitudes, como los rangos de longitudes de onda de excitación y emisión, la intensidad de dichas señales, o el tiempo de vida medio de la emisión. El perfil de decaimiento de la emisión fluorescente viene caracterizado por la caída de la intensidad con el tiempo una vez suprimida la fuente de excitación. Dicha caída toma a menudo una forma de caída monoexponencial, aunque diferentes circunstancias, como la presencia de varios fluoróforos o la inhomogeneidad de la muestra, hacen que dicho perfil se aproxime a menudo a una caída multiexponencial. En la figura 1 se puede observar un ejemplo del típico patrón de decaimiento de una emisión fluorescente. El pulso de excitación (1) activa la emisión fluorescente (2 y 3) de distintos fluoróforos. La señal compuesta de caída en este ejemplo sería una caída biexponencial (4). La información que proporciona la medida de el (los) tiempo(s) de vida medio(s) es a menudo de utilidad dado que se ve modificado por diversos factores que estén afectando a la sustancia fluores- cente.

Para medir dicho tiempo de vida, existen dos tipos fundamentales de métodos, los basados en medidas en el dominio del tiempo y aquellos basados en medidas en el dominio de la frecuencia, ambos de uso muy extendido. Los basados en el dominio del tiempo se basan en la medida directa del tiempo de caída con instrumentación a menudo compleja y sofisticada, como es el método de conteo de fotones individuales correlado en el tiempo (time-correlated single photon counting). Los métodos basados en el dominio de la frecuencia, a los que esta invención se refiere, se basan en la excitación de la muestra con una intensidad de luz modulada a determinada frecuencia, y la detección de la información de fase y amplitud de la señal fluorescente emitida.

La respuesta de una sustancia fluorescente ante una excitación modulada a una frecuencia determinada f es una señal también modulada a esa misma frecuencia y caracterizada por una determinada amplitud y un desfase con respecto a la señal de excitación. Dado que las señales de excitación y de fluorescencia comparten la misma frecuencia y se diferencian en su amplitud y fase, es común representar ambas por un vector complejo llamado fasor, cuyo módulo y fase se corresponden con la amplitud y el desfase de la sinusoidal correspondiente, respectivamente. Dado que el fasor es un número complejo, queda también completamente definido expresándolo en su forma cartesiana (a + j•b), refiriéndonos a él entonces por su parte real y su parte imaginaria. A lo largo de este documento se usará la referencia al módulo, fase, parte o componente real o imaginaria de una señal para referirse a la característica correspondiente del fasor asociado.

Para una sustancia cuya fluorescencia presenta una evolución temporal que se aproxima a una caída multi-exponencial, de acuerdo con la siguiente expresión:

La dependencia de la amplitud (normalizada al valor de bajas frecuencias) y la fase de la señal fluorescente (con respecto a la señal de excitación) viene determinada por el módulo y la fase del fasor complejo I_f(f) (siendo j = sqrt{-1} la unidad imaginaria):

Que, para el caso de una caída mono-exponencial, se simplifica a:

Siendo A(f) el módulo del fasor y φ(f) la fase del mismo.

Nótese el empleo de la tipografía cursiva f para referirse a la frecuencia y la tipografía redonda f para hacer referencia a las variables correspondientes a alguna propiedad de la señal de fluorescencia.

De estas ecuaciones se deduce que al excitar la sustancia fluorescente con luz modulada sinusoidalmente, la emisión será también una señal modulada sinusoidalmente, cuya amplitud de modulación disminuirá, y cuya fase crecerá con la frecuencia. Este efecto se ilustra en la figura 2 en el dominio del tiempo, y en la figura 3 en el dominio de la frecuencia para una caída monoexponencial. En la figura 2 se representa la amplitud de modulación normalizada de la señal de excitación (5) y la señal fluorescente (6) para el caso de f = 1/2πτ. Se puede observar que la señal fluorescente (6) se ha desfasado con respecto de la de excitación (5). En la figura 3 se representa la amplitud (7) y la fase (8) en función de la frecuencia (normalizada al valor 1/2πτ). Como se puede observar, la amplitud (7) decrece al aumentar la frecuencia, mientras que la fase (8) aumenta de 0º a 90º.

A partir de datos sobre la amplitud y la fase de modulación de la señal fluorescente en el dominio de la frecuencia se puede, por tanto, obtener información sobre las constantes que caracterizan la caída temporal de la fluorescencia. Según la cantidad de datos aportados, sean estos una exploración continua del espectro de frecuencias en amplitud y fase, o incluso la simple medida de la fase a una frecuencia determinada, será mayor o menor la información que se pueda deducir. Según la información que se desee obtener en cada experimento y los límites en los que se conoce a priori que puede variar dicha información, será necesario realizar un barrido más o menos exhaustivo.

En los sistemas más completos, se realiza un barrido exhaustivo de frecuencias registrando la amplitud de la modulación y el desfase, y se hace un ajuste de los resultados a un modelo uni- o multi-exponencial, obteniendo como resultado los valores de tiempos de vida τ_i e intensidades relativas α_i, deseados. En equipos para aplicaciones más específicas o con mayores requisitos de portabilidad, a menudo no es necesario obtener información tan completa o tan robusta sobre los tiempos de vida. En estas aplicaciones a menudo se ignora la información de amplitud, ya que esta está sujeta a derivas, como por ejemplo por la disminución de moléculas de fluoróforo o las variaciones a largo plazo de intensidad de la fuente de excitación, y se trabaja únicamente con la fase, proporcionando una medida más robusta frente a este tipo de variaciones. Existen aparatos en el mercado, de hecho, en los que la medida se obtiene únicamente de la medida de la fase a una única frecuencia de modulación, ya que esto es suficiente para obtener la información que se desea en la aplicación para la que están diseñados. Habitualmente se obtiene la amplitud de la modulación y/o la fase a través de un esquema de correlación cruzada o demodulación heterodina de la señal (siendo la frecuencia de modulación de la excitación f_s, se multiplica la señal por una portadora de una frecuencia f_s+f_i, con el resultado de obtener una señal...

1. Método de medida del patrón de decaimiento temporal de la intensidad fluorescente en el dominio de la frecuencia, caracterizado por los siguientes pasos: