Método y kit para predecir la supervivencia de pacientes con linfoma de células del manto.

El linfoma de células del manto (LCM) es un subtipo diferenciado de linfoma no-Hodgkin de células B (LNH-B). La invención proporciona un método y un kit para la predicción de la supervivencia de un paciente que sufre un LCM, basado en la medida del nivel de expresión de al menos cuatros genes seleccionados del grupo que consiste en: MYC, RAN, POLE2, SLC29A2 y TNFRSF10B en la muestra del paciente. El método y kit son simples por implicar un número mínimo de genes, cuantitativos, aplicables en el diagnóstico de rutina a una gran variedad de muestras, y proporcionan una capacidad de predicción de la supervivencia de los pacientes con LCM más elevada que los métodos actuales

Método y kit para predecir la supervivencia de pacientes con linfoma de células del manto.

La presente invención se relaciona con métodos de diagnóstico y pronóstico de tumores malignos, en particular, linfomas malignos, y más particularmente con métodos de diagnóstico y pronóstico del linfoma de células del manto.

Estado de la técnica anterior

El linfoma de células del manto (LCM) es un subtipo diferenciado de linfoma no-Hodgkin de células B (LNH-B) caracterizado por la translocación t(11;14)(q13;32) y la sobreexpresión de la Ciclina D1. El curso clínico de estos enfermos puede ser muy variable. Generalmente, el LCM muestra un comportamiento clínico agresivo con poca respuesta a los tratamientos existentes en la actualidad, y la supervivencia media de los pacientes de LCM después del diagnóstico se sitúa entre los 3 y 5 años. De todos modos, algunos pacientes mueren por la enfermedad en menos de 6 meses, mientras que otros sobreviven más de 10 años. Las aproximaciones terapéuticas actuales para los pacientes de LCM son bastante uniformes y raramente reflejan este comportamiento clínico ampliamente variable.

En los últimos años, se han llevado a cabo muchos intentos para identificar marcadores clínicos, histológicos y moleculares que permitan estratificar los pacientes de LCM en diferentes grupos de riesgo. Morfológicamente, se han identificado dos variantes de LCM, llamadas variantes típica o clásica y blastoide. Los casos de LCM blastoides muestran un comportamiento clínico peor. Genéticamente, las alteraciones que afectan la maquinaria del ciclo celular y las vías de respuesta al daño del ADN parecen ser características del LCM. Las alteraciones genéticas secundarias en LCM afectan frecuentemente reguladores clave de estas vías y también se asocian con un comportamiento clínico inferior.

El predictor más fuerte de la supervivencia en los pacientes con LCM se identificó mediante el análisis de los perfiles de expresión génica de una serie grande de pacientes con LCM (Rosenwald A. et al., "The proliferation gene expression signature is a quantitative integrator of oncogenic events that predicts survival in mantle cell lymphoma", Cancer Cell, 2003, vol. 3, p. 185-197). En particular, se construyó un predictor molecular basado en la expresión génica de 20 genes asociados con la proliferación que permitió la definición de subgrupos pronóstico de pacientes con LCM en que la supervivencia media difería en cerca de 6 años. Este predictor de la supervivencia demostró ser superior a otros marcadores moleculares pronóstico tanto solos como en combinación y por lo tanto se vio como un integrador de múltiples eventos oncogénicos (Rosenwald et al., arriba). La plataforma técnica basada en microarrays actualmente no es factible para su aplicación en la rutina clínica.

El marcador indirecto potencial Ki-67 medido por inmunohistoquímica ha atraído mucha atención recientemente. En diversos estudios, índice elevados de Ki-67 en células tumorales de LCM se relacionaron con menor supervivencia de los pacientes y la medida de la proliferación de las células tumorales a través de Ki-67 es ahora parte del procedimiento de rutina diagnóstica en muchos centros de linfoma. De todos modos, las técnicas inmunohistoquímicas son sólo semicuantitativas y, en un reciente estudio multicéntrico de inmunohistoquímica, la concordancia entre los procedimientos de tinción y valoración de Ki-67 en diversos laboratorios con experiencia fue menos que satisfactoria.

Explicación de la invención

Los presentes inventores han desarrollado un modelo preciso y cuantitativo de la supervivencia de los pacientes de LCM basado en la expresión génica que implica un mínimo número de genes y es aplicable en la rutina diagnóstica tanto en tejidos frescos congelados como en tejidos fijados en formol e incluidos en parafina (FFIP) de pacientes con LCM.

Así, en un aspecto la presente invención proporciona un método de predicción de la supervivencia de un paciente que sufre un linfoma de células del manto, comprendiendo los pasos de (a) obtener una muestra de dicho paciente; (b) medir el nivel de expresión de al menos cuatros genes seleccionados del grupo que consiste en: MYC, RAN, POLE2, SLC29A2 y TNFRSF10B en dicha muestra; y (c) comparar el nivel de expresión de cada uno de los genes medidos con la expresión de uno o más genes control endógenos. El test de la presente invención permite una predicción cuantitativa del curso clínico de los pacientes de LCM en el momento del diagnóstico, basado en las medidas de expresión génica de al menos cuatro de los cinco genes referenciados más arriba. Ventajosamente el test de la invención es aplicable en la mayoría de casos de LCM con tejido congelado y/o FFIP disponible. La alta expresión de RAN, MYC, POLE2 y SLC29A2 se relaciona con un peor pronóstico, mientras que la expresión incrementada de. El test de la presente invención permite una predicción cuantitativa del curso clínico de los pacientes de LCM en el momento del diagnóstico, basado en las medidas de expresión génica de al menos cuatro de los cinco genes referenciados más arriba. Ventajosamente el test de la invención es aplicable en la mayoría de casos de LCM con tejido congelado y/o FFIP disponible. La alta expresión de RAN; MYC, POLE2 y SLC29A2 se relaciona con un peor pronóstico, mientras que la expresión incrementada de TNFRSF10B correlaciona con un curso clínico más favorable.

Por otro lado, como se ha mencionado arriba el índice Ki-67 es capaz de definir grupos de riesgo en muestras FFIP de pacientes con LCM. La evaluación del índice Ki-67 se basa en observaciones microscópicas individuales hechas por un patólogo. La mayoría de las series publicadas representan investigaciones llevadas a cabo en una única institución. Por ejemplo, en un reciente estudio multicéntrico de inmunohistoquímica, se encontró que la variación entre laboratorios en los procedimientos de tinción y valoración de Ki-67 era sorprendentemente alta.

El test de la presente invención proporciona una medida cuantitativa de los niveles de expresión de genes asociados a la proliferación mejorando la capacidad predictiva de las técnicas inmunohistoquímicas existentes que en su mayoría son semicuantitativas (Rosenwald et al., arriba). Como se ilustra más abajo, el test parece superior, ya que discrimina mejor la supervivencia de los pacientes, y es más objetivo que la medida inmunohistoquímia del índice Ki-67, siendo posible su aplicación usando una plataforma técnica automatizada. Mediante la integración de esta aproximación en estudios futuros de LCM, parece posible la realización de un paso adelante hacia una terapia de LCM adaptada al riesgo a sufrir la enfermedad. Esto es de gran importancia, ya que con el método de acuerdo con la presente invención es posible determinar cómo de agresivo es un linfoma y, por lo tanto, es posible establecer el tratamiento apropiado para el paciente. Por lo tanto, con el método de invención, se pueden probar en procesos clínicos prospectivos estrategias más individualizadas y adaptadas al riesgo.

En una realización del primer aspecto de la invención el tejido de la muestra es fresco, congelado o fijado en formol e incluido en parafina.

Las técnicas inmunohistoquímicas conocidas necesitan que la muestra esté en fresco. Los ácidos nucleicos del material FFIP están frecuentemente degradados debido al proceso de fijación con formol. Además, la fijación química modifica la estructura del ARN en tejidos tumorales impidiendo el análisis subsiguiente por técnicas moleculares como la RT-PCR cuantitativa. Esto es debido a que estas técnicas se basan en ciertos genes (genes marcadores) que se pueden romper en fragmentos si la muestra se procesa (es decir, congelada, fijada en formol o incluida en parafina). Si los genes marcadores se rompen en fragmentos, la información obtenida de estos tests no refleja la situación real del paciente. Esto significa que cuando el médico tiene que determinar la supervivencia del paciente, el tiempo pasado entre la extracción de la muestra (tejido) y el análisis tiene que ser cuanto más corto mejor para evitar la fragmentación de los genes marcadores presentes en la muestra del paciente y, por tanto, para evitar la pérdida de información que se necesita para hacer la estimación real del tiempo de supervivencia del paciente.

Sorprendentemente, el test de la presente invención puede llevarse...

1. Método para predecir la supervivencia de un paciente que sufre un linfoma de células del manto, comprendiendo los pasos de (a) obtener una muestra de dicho paciente; (b) medir el nivel de expresión de al menos cuatros genes seleccionados del grupo que consiste en: MYC, RAN, POLE2, SLC29A2 y TNFRSF10B en dicha muestra; y (c) comparar el nivel de expresión de cada uno de los genes medidos con la expresión de uno o más genes control endógenos.

2. Método según la reivindicación 1, donde si el nivel de expresión de los genes RAN, MYC, POLE2 y SLC29A2 es mayor que el nivel de expresión del gen control endógeno y el nivel de expresión de TNFRSF10B es menor que el nivel de expresión del gen control endógeno se correlacionan con un peor pronóstico.

3. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde la muestra es una muestra de tejido que es fresca, congelada o fijada en formol e incluida en parafina.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde se mide el nivel de expresión de cuatro genes seleccionados del grupo que consiste en: MYC, RAN, POLE2, SLC29A2 y TNFRSF10B.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde se mide el nivel de expresión de MYC, RAN, POLE2, SLC29A2 y TNFRSF10B.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde los niveles de expresión génica se miden por la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa a tiempo real.

7. Método según la reivindicación 6, donde el tamaño del amplicón para cada uno de los genes MYC, RAN, POLE2, SLC29A2 y TNFRSF10B es igual o menor que 80 pares de bases.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el gen control endógeno es B2M.

9. Kit para llevar a cabo el método definido en la reivindicación 1, que comprende medios adecuados para medir el nivel de expresión de al menos cuatro de los genes seleccionados del grupo que consiste en: MYC, RAN, POLE2, SLC29A2 y TNFRSF10B y de uno o más genes control endógenos.

10. Kit según la reivindicación 9, donde los medios adecuados comprenden dos pares de oligonucleótidos adecuados como cebadores para la amplificación de al menos cuatro de los genes seleccionados del grupo que consiste en: MYC, RAN, POLE2, SLC29A2 y TNFRSF10B y de uno o más genes control endógenos.

11. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 9-10, que comprende dos pares de oligonucleótidos adecuados como cebadores para la amplificación de los genes MYC, RAN, POLE2, SLC29A2 y TNFRSF10B.

12. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 9-10, que comprende substancias requeridas para llevar a cabo la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real.

13. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, donde el gen control endógeno es B2M.

14. Uso del kit como se define en cualquiera de las reivindicaciones 9-13, en la predicción de la supervivencia de un paciente que sufre un linfoma de células del manto.