MÉTODO PARA PRODUCIR POLIPÉPTIDOS DE INSULINA MADUROS.

Método para producir polipéptidos de insulina maduros CAMPO DE LA INVENCIÓN [0001] La presente invención se refiere a un proceso de producción de análogos de insulina humana en levadura. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN [0002] La insulina es una hormona polipéptida producida en las células beta de los islotes de Langerhans. La molécula de insulina activa es una molécula bicatenaria que consiste en una cadena B y una cadena A conectadas por dos puentes disulfuros. La insulina se sintetiza como una molécula precursora de proinsulina con estructura B-C-A, donde la cadena de péptido C conecta el residuo de aminoácido C-terminal de la cadena B con el residuo de aminoácido Nterminal de la cadena A. La insulina madura bicatenaria se forma por escisión del péptido C en el par de residuos de aminoácidos básicos situados en las uniones con las cadenas A y B. Las cadenas A y B se mantienen unidas por dos puentes disulfuros entre los residuos Cys A7 y B7, y A20 y B19 respectivamente. Además, la molécula de insulina biológicamente activa tiene un puente disulfuro interno entre los residuos Cys en las posiciones A6 y A11. [0003] Después del desarrollo de tecnología del ADN recombinante, se han descrito numerosos métodos para producir insulina y precursores de los mismos en células huésped genéticamente modificadas. Así, los métodos para producir insulina a partir de E.coli, se describen en, por ejemplo, Frank, B.H., Pettee, J.M., Zimmerman, R.E. & Burck, P.J. En: Peptides. Synthesis-Structure-Function. Proceedings of the Seventh American Symposium (D.H.Rich y E.Gross, eds). Pierce Chemical Company, p. 729 (1981). Como la E.coli no tiene la maquinaria celular para el pliegue del polipéptido expresado y para establecer los puentes disulfuros que conectan las cadenas A y B en la insulina madura, esta estrategia incluye varios pasos de tratamiento in vitro, tales como el establecimiento in vitro de los puentes disulfuros durante el replegado y la escisión posterior del péptido C. [0004] A diferencia de la E.coli, las eucariotas contienen la maquinaria necesaria para el pliegue y el establecimiento de los puentes disulfuros y por consiguiente parecen ser buenas candidatas para la producción de insulina madura en organismos genéticamente modificados. La patente estadounidense 4.914.026 describe un proceso para producir insulina madura en levadura por inserción del gen de la proinsulina humana, enlazado a la secuencia guía de factor- en una célula huésped de levadura y el cultivo de la célula de levadura transformada en un medio nutritivo bajo unas condiciones por las cuales la proinsulina se expresa y secreta de forma madura. [0005] Thim et al, Proc Natl. Acad. Sci. EEUU, volumen 83, 6766-6770, describe la expresión de la proinsulina humana y varios precursores de insulina con un péptido C modificado, tal como RREAENLQKR (SEC ID NO:1), RREAPLQKR (SEC ID NO:2), RREALQKR (SEC IDNO:3), KREALQKR (SEC ID NO:4) y RRLQKR (SEC ID NO:5). SEC ID NO:5 es también descrito por Thim et al, in FEBS Letters, volumen 212, número 2, 307-312. [0006] Además, en WO 97/03089 se divulgaba la expresión de los precursores de la insulina con la fórmula BZA donde B y A son las cadenas de péptidos de la insulina humana A y B que están unidas por al menos un enlace de disulfuro y Z es un polipéptido que comprende al menos un zona de escisión proteolítica, por ejemplo KREQKLISEEALVDKR (SEC ID NO:6). [0007] No obstante, los precursores de insulina descritos sólo dan lugar a pequeñas cantidades de insulina madura secretada en el medio de cultivo. [0008] La solicitud de patente europea, 0163529A, las solicitudes de patente PCT Nos. WO 95/02059 y WO 90/10075 divulgan procesos para hacer insulina y análogos de insulina basados en la expresión de un precursor de la insulina o análogo de la insulina en levadura, que siguiendo la recuperación inicial del caldo de fermentación son enzimáticamente convertidos en insulina madura o análogo de insulina. Las moléculas precursoras comprenden ciertos péptidos C modificados y pueden comprender además una extensión N-terminal de la cadena B de la insulina. El péptido C modificado y la posible extensión N-terminal del péptido B están diseñados no para ser escindidos en la célula de levadura y que así los precursores se secreten como péptidos monocatenarios donde las cadenas A y B se conectan con el péptido C modificado, sino con puentes disulfuros correctamente dispuestos. La insulina madura o el producto análogo de insulina se obtiene entonces mediante varios pasos enzimáticos in vitro posteriores para disociar el péptido C y posiblilitar la extensión N-terminal. Estos pasos enzimáticos conllevan mucho tiempo, son frecuentemente costosos, e introducen impurezas adicionales que posteriormente se deben eliminar en pasos adicionales de un proceso posterior, como los costosos pasos de la cromatografía y similares. [0009] En la patente estadounidense nº 6.348.327 se divulga un proceso para producir insulina madura en células animales genéticamente modificadas que no son capaces de generar gránulos secretores de forma natural. [0010] El propósito de la presente invención es desarrollar una cepa de hongos capaz de secretar análogos de insulina humana madura completamente procesada, de modo que se puedan evitar los pasos costosos y de larga duración del 2   proceso de purificación posterior. RESUMEN DE LA INVENCIÓN [0011] En un aspecto, la invención se refiere a un método para producir un análogo de insulina humana madura mediante cultivo de una célula fúngica que comprende un vector de ADN que codifica un precursor para el análogo de insulina humana, donde dicho precursor comprende un péptido conector flanqueado con un zona de escisión Kex2 en ambas uniones de las cadenas A y B del péptido de la insulina, respectivamente, siendo dichos sitios de escisión escindidos dentro de la célula fúngica, permitiendo de esta forma a la célula secretar el análogo de insulina humana bicateriano, maduro y correctamente procesado a los medios de cultivo, y donde el análogo de insulina tiene una mutación en al menos una de las posiciones A8; B10; A18 y A14 en la cadena A y/o B de insulina humana. [0012] Los análogos de insulina humana según la presente invención serán expresados como precursores monocatenarios en la célula fúngica y serán escindidos en la célula y secretados como análogos maduros bicatenarios de insulina humana sin la necesidad de otro tratamiento in vitro. [0013] El péptido conector tendrá una composición de aminoácidos que sea óptima para asegurar la escisión dentro de la célula del hongo para secretar el polipéptido análogo de insulina madurado correctamente. [0014] En una forma de realización de la invención, el residuo de aminoácido en la penúltima posición de la zona de escisión adyacente a la cadena A, es seleccionado del grupo consistente en Phe, Leu, Ile, Tyr, Trp, Val, Met y Ala. [0015] En otra forma de realización de la invención, el péptido conector comprenderá un residuo de aminoácido Leu, Ile, Tyr, Arg, Lys, His, Pro, Phe, Trp, Met, Val o Ala, en la penúltima posición de la zona de escisión adyacente a la cadena A. [0016] En otra forma de realización de la invención, el péptido conector comprenderá un residuo de aminoácido Leu o Ile en esta posición. [0017] También se ha descubierto que el residuo de aminoácido en la misma posición no debería ser Asp, Glu o Gly. [0018] El tamaño del péptido C en la insulina humana es de 35 residuos de aminoácidos. Así, en un aspecto de la presente invención, el péptido conector será aproximadamente de la misma longitud del péptido C natural. [0019] En una forma de realización el péptido conector será de 2-35, 2-34, 2-33, 2-31, 2-30, 2-29, 2-28, 2-27, 2-26, 2-25, 2-24, 2-23, 2-22, 2-21, 2-20, 2-19, 2-18, 2-17, 2-16, 2-15, 2-14, 2-13, 2-12, 2-11, 2-10, 2-9, 2-8, 2-7, 2-6, 2-5, 2-4 ó 2-3 residuos de aminoácidos. [0020] En otra forma de realización el péptido conector será de 3-35,3-34, 3-33, 3-32, 3-31, 3-30, 3-29, 3-28, 3-27, 3-26, 3-25, 3-24, 3-23, 3-22, 3-21, 3-20, 3-19, 3-18, 3-17, 3-16, 3-15, 3-14, 3-13, 3-12, 3-11, 3-10, 3-9, 3-8, 3-7, 3-6, 3-5, 3-4 residuos de aminoácidos. [0021] En otra forma de realización el péptido conector consistirá en 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 31, 32, 33, 34 ó 35 residuos de aminoácidos. [0022] La célula fúngica secretará cantidades altas de análogos de insulina humana correctamente procesados y en una forma de realización la célula fúngica es capaz de secretar al menos aproximadamente de 20 a 50 mg/litro de análogo maduro bicatenario de insulina humana correctamente procesado a los medios de cultivo. [0023] La célula fúngica es típicamente capaz de secretar al menos aproximadamente de 20 a 80 mg/litro o al menos aproximadamente... [Seguir leyendo]

1. Método para producir un análogo de insulina humana maduro mediante el cultivo de una célula fúngica que comprende un vector de ADN que codifica un precursor para el análogo de insulina humana, donde dicho precursor comprende un péptido conector flanqueado con un zona de escisión Kex2 en ambas uniones de las cadenas A y B del péptido de insulina, respectivamente, estando dichas zonas de escisión divididas en la célula fúngica permiten a la célula a secretar el análogo de insulina humana bicatenario maduro correctamente procesado a los medios de cultivo y donde el análogo de insulina tiene una mutación en al menos una de las posiciones A8, B10, A18 y A14 de las cadenas A y/o B de la insulina humana. 2. Método según la reivindicación 1, donde el residuo de aminoácido en el péptido conector en la penúltima posición del zona de escisión junto a la cadena A es seleccionado del grupo que consiste en Leu, Ile, Tyr, Arg, Lys, His, Pro, Met, Val, Ala y Phe. 3. Método según la reivindicación 2, donde el residuo de aminoácido es seleccionado del grupo que consiste en Leu e Ile, 4. Método según las reivindicaciones 1-2, donde el péptido conector tiene un tamaño de 3-35, 3-34, 3-33, 3-31, 3-30, 3-29, 3-28, 3-27, 3-26, 3-25, 3-24, 3-23, 3-22, 3-21, 3-20, 3-19, 3-18, 3-17, 3-16, 3-15, 3-14, 3-13, 3-12, 3-11, 3-10, 3-9, 3-8, 3-7, 3-6, 3-5 o 3-4 residuos de aminoácidos. 5. Método según la reivindicación 1, donde las mutaciones son seleccionadas del grupo que consiste en Asp, Glu, His, Gln y Arg. 6. Método según la reivindicación 5, donde los análogos de insulina B10Glu, A8His, A14Glu insulina humana. 7. Método según la reivindicación 1-6, donde la célula fúngica es una célula de levadura. 8. Método según la reivindicación 1, donde el análogo de precursor de insulina humana tiene la secuencia de aminoácidos B(1-30)- X-X-Z-Y-Y-A(1-21) donde B(1-30) es la cadena B de la insulina humana, A(1-21) es la cadena A de la insulina humana, X-X e Y-Y son ambos un sitio Kex2 y Z es una secuencia peptídica con de 1 a 35 residuos de aminoácidos, con la condición de que al menos uno de los residuos de aminoácidos naturales en una de las posiciones A8, B10, A18 y A14 de las cadenas A y/o B de la insulina humana mute en otro residuo de aminoácido. 9. Secuencia de ADN que codifica un precursor de insulina con la secuencia de aminoácidos B(1-30)- X-X-Z-Y-Y-A(1- 21) donde B(1-30) es la cadena B de la insulina humana, A(1-21) es la cadena A de la insulina humana, cada X-X e YY son ambos un sitio Kex2 y Z es una secuencia peptídica con de 1 a 35 residuos de aminoácidos, con la condición de que al menos uno de los residuos de aminoácidos naturales en al menos una de las posiciones A8, B10, A18 y A14 en las cadenas A y/o B de la insulina humana mute en otro residuo de aminoácido. 10. Vector de expresión que comprende una secuencia de ADN según la reivindicación 9. 11. Célula de levadura transformada con el vector según la reivindicación 10.   26   27