Método para la detección simultánea de histoplasma capsulatum y paracoccidioides brasiliensis.

La presente invención se refiere a un método de detección simultánea de ADN de Histoplasma capsulatum y Paracoccidioides brasiliensis mediante la técnica de PCR multiplex cuantitativa en tiempo real, basada en sondas específicas marcadas con dos fluoróforos diferentes. Esta técnica es aplicable tanto en muestras biológicas como en cultivos microbiológicos y muestras ambientales. Además, otro aspecto de la invención es un kit que permite detectar los dos microorganismos de forma simultánea

Método para la detección simultánea de Histoplasma capsulatum y Paracoccidioides brasiliensis.

La presente invención se refiere a un método de detección simultánea de ADN de Histoplasma capsulatum y Paracoccidioides brasiliensis mediante la técnica de PCR multiplex cuantitativa en tiempo real, basada en sondas específicas marcadas con dos fluoróforos diferentes. Esta técnica es aplicable tanto en muestras biológicas como en cultivos microbiológicos y muestras ambientales. Además, otro aspecto de la invención es que se ha desarrollado un kit que permite detectar los dos microorganismos de forma simultánea.

Estado de la técnica anterior

Los microorganismos Histoplasma capsulatum y Paracoccidioides brasiliensis son los causantes de las enfermedades conocidas como histoplasmosis y paracoccidioidomicosis. Estas enfermedades son micosis primarias de aparición frecuente en determinadas zonas geográficas especialmente en áreas tropicales y subtropicales de clima templado y húmedo. En estas zonas endémicas, la aparición del SIDA ha agravado el problema de las micosis primarias hasta convertirlo en una de las patologías más frecuentes. La prevalencia de estas enfermedades está aumentando en España debido a infecciones importadas en viajeros o emigrantes procedentes de zonas endémicas, especialmente de la población procedente de Latinoamérica. Según el Instituto Nacional de Estadística (www.ine.es), un 35% de la población emigrante que reside en España hbox{procede de zonas endémicas y, además, un millón de españoles viaja cada año a estos países.}

En zonas endémicas, la histoplasmosis es una de las infecciones oportunistas más frecuentes en pacientes con SIDA. Por tanto, la histoplasmosis debe ser incluida en el diagnóstico diferencial de pacientes sudamericanos con SIDA, con signos de infección sistémica y afectación del sistema mononuclear-fagocítico. En el caso de la histoplasmosis del viajero o del turista, la enfermedad se manifiesta como una infección respiratoria que puede variar en cuanto a su sintomatología, desde un cuadro catarral a una infección grave que pone en peligro la vida del enfermo.

Respecto a la paracoccidioidomicosis, es la micosis sistémica más frecuente de América Tropical y, aunque en Europa es poco frecuente, se han descrito varios casos en los últimos años asociados a población procedente de regiones endémicas. Generalmente estos pacientes presentan la forma crónica de la enfermedad que puede ser unifocal afectando al pulmón o multifocal representada por una serie de lesiones cutáneas o mucosas y con afectación del pulmón. Es frecuente, además, que hayan transcurrido varios años desde que se adquiere la enfermedad hasta que se desarrollan los síntomas. La paracoccidioidomicosis también debe ser incluida en el diagnóstico diferencial en pacientes procedentes de Latinoamérica con una infección respiratoria, aparezcan o no lesiones cutáneas.

El diagnóstico de ambas micosis es complicado por lo que, hasta la fecha, el diagnostico de certeza se ha basado en el cultivo del microorganismo y posterior identificación mediante técnicas microscópicas o de detección de exoantígenos. No obstante, el cultivo puede tardar 1 ó 2 semanas en ser positivo y la identificación puede resultar compleja en centros sin experiencia. La visión de estructuras fúngicas puede ayudar a iniciar el tratamiento, pero no confirma el diagnóstico. Las pruebas serológicas también pueden ayudar al diagnóstico, pero tienen una especificidad limitada en zonas endémicas y una sensibilidad baja en enfermos inmunodeprimidos. Por otra parte, en el caso de la histoplasmosis, existe una técnica de detección de antígeno en orina, que tiene una gran fiabilidad, incluso en enfermos inmunodeprimidos. Pero, hasta la fecha, esta técnica no se ha comercializado y sólo está disponible en centros de referencia de los EE.UU.

Ante esta situación, el Servicio de Micología del Centro Nacional de Microbiología ha desarrollado el procedimiento descrito en esta invención para detectar simultáneamente ambos patógenos fúngicos ya que la clínica es similar en ambos y la población susceptible de ser afectada por dichos patógenos es la misma.

El método descrito en la presente invención provee de una herramienta que soluciona algunos de los problemas presentados por otros métodos, ya que se reduce de manera significativa el tiempo empleado por los métodos diagnósticos convencionales (se reduce de 1-2 semanas a 1-2 días) y sirve para detectar simultáneamente ambos microorganismos Histoplasma capsulatum y Paracoccidioides brasiliensis. Asimismo, la rapidez en la detección permitirá adelantar el inicio del tratamiento de la histoplasmosis y/o de la paracoccidioidomicosis, mejorando el pronóstico de los enfermos y permitirá realizar el seguimiento de la respuesta al tratamiento.

Explicación de la invención

En la presente invención se describe un método de detección simultánea de ADN de Histoplasma capsulatum y Paracoccidioides brasiliensis mediante la técnica de PCR multiplex cuantitativa en tiempo real, basada en sondas específicas del tipo molecular beacon (faro molecular) marcadas con dos fluoróforos diferentes.

Los molecular beacons son sondas que tienen una forma de horquilla o de bucle, incorporando un fluoróforo emisor y un quencher, que inhibe la emisión de fluorescencia mientras que la sonda no hibride. Cuando la sonda se une al ADN, se forma una doble hélice rígida, por lo que la sonda pierde su forma de horquilla, separándose el emisor del quencher, lo que origina la fluorescencia detectable. Los moleculars beacons constan de 10-30 pares de bases, permiten la detección de cambios de una sola base y son sondas especialmente indicadas para usar en ensayos de PCR multiplex ya que pueden marcarse con diferentes fluoróforos y poseen unas propiedades termodinámicas que favorecen una alta especificidad.

El método descrito en la presente invención presenta una serie de ventajas respecto de las técnicas convencionales:

En cuanto a las características innovadoras, pueden destacarse:

En este sentido, un primer aspecto de la presente invención es un método para la detección simultánea de Histoplasma capsulatum y Paracoccidioides brasiliensis que comprende:

1. Método para la detección simultánea de Histoplasma capsulatum y Paracoccidioides brasiliensis que comprende:

2. Método según la reivindicación 1 donde la concentración del ADN aislado para llevar a cabo la amplificación es de al menos 10 fg/μl.

3. Método según la reivindicación 1 donde la muestra es:

4. Método según la reivindicación 3 donde la muestra biológica está relacionada con el aparato respiratorio.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 donde la amplificación de la región ITS2 del ADN ribosómico de Histoplasma capsulatum se realiza por medio de los cebadores SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 y la amplificación de la región ITS1 del ADN ribosómico de Paracoccidioides brasiliensis se realiza por medio de los cebadores SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 donde la amplificación se realiza por medio de PCR multiplex en tiempo real caracterizada porque se emplean sondas específicas marcadas con dos fluoróforos diferentes.

7. Método según la reivindicación 6 donde las sondas son:

8. Método según la reivindicación 7 donde el fluoróforo del apartado (a) es FAM, el fluoróforo del apartado (b) es HEX y el quencher es BHQ1.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para la monitorización de la respuesta a un tratamiento de histoplasmosis y/o paracoccidioidomicosis.

10. Kit para la detección simultánea de Histoplasma capsulatum y Paracoccidioides brasiliensis que comprende pares de cebadores que pueden amplificar, mediante la técnica de la PCR, un fragmento de la región ITS del ADN ribosómico de Histoplasma capsulatum y/o Paracoccidioides brasiliensis.

11. Kit según la reivindicación 10 que comprende los cebadores SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 para amplificar un fragmento de la región ITS2 del ADN ribosómico de Histoplasma capsulatum y los cebadores SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5 para amplificar un fragmento de la región ITS1 del ADN ribosómico de Paracoccidioides brasiliensis.

12. Kit según la cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11 donde la amplificación se realiza por medio de PCR multiplex en tiempo real y se emplean sondas específicas marcadas con dos fluoróforos diferentes.

13. Kit según la reivindicación 12 donde las sondas son:

14. Kit según la reivindicación 13 donde el fluoróforo del apartado (a) es FAM, el fluoróforo del apartado (b) es HEX y el quencher es BHQ1.

15. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, para el diagnóstico de histoplasmosis y/o paracoccidioidomicosis en una muestra biológica, ambiental o en un cultivo microbiológico.

16. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, para la monitorización de la respuesta a un tratamiento de histoplasmosis y/o paracoccidioidomicosis.