Método para la detección, identificación y cuantificación de Peronospora arborescens por PCR cuantitativa en tiempo real.

El método para la cuantificación de Peronospora arborescens por PCR cuantitativa (qPCR) en una muestra biológica, comprende extraer el ADN contenido en dicha muestra biológica y amplificarlo mediante qPCR. De aplicación en la cuantificación de P. arborescens

Método para la detección, identificación y cuantificación de Peronospora arborescens por PCR cuantitativa en tiempo real.

Campo de la invención

La invención se relaciona, en general, con la cuantificación de patógenos de plantas, y, en particular, con un método para la cuantificación de Peronospora arborescens basado en la amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) cuantitativa de regiones específicas en el ADN de dicho patógeno.

Antecedentes de la invención

La adormidera (Papaver somniferum) es la única fuente de morfina, codeína y tebaína farmacéuticas, que son fármacos clave para aliviar el dolor crónico asociado con enfermedades de cáncer. En España se cultivan anualmente alrededor de 9.500 hectáreas de adormidera, principalmente en las regiones meridional (Andalucía) y central (Castilla-La Mancha y Castilla-León) del país (Landa, B. B. et al.; 2007. Phytopathology 97:1380-1390, Montes-Borrego, M. et al. 2009; Phytopathology 99:73-81). Esta superficie de cultivo representa cerca del 5% de la adormidera cultivada de manera legal en todo el mundo, lo que hace que España sea, respectivamente, el tercer y cuarto productor más grande de Europa y mundial de paja de adormidera rica en morfina.

Los cultivos comerciales de adormidera en España pueden verse afectados por varias enfermedades de etiología diversa (Aranda, S. et al. 2008. Plant Dis. 2:317, Landa, B. B. et al.; 2007. Phytopathology 97:1380-1390). Sin embargo, durante los últimos 5 años el "Mildiu" se ha convertido en el principal factor que limita el rendimiento de este cultivo en el país (Montes-Borrego, M. et al. 2009; Phytopathology 99:73-81). En la actualidad, los ataques del Mildiu se producen en todas las áreas que cultivan adormidera en España y su incidencia y gravedad han aumentado continuamente desde que se registraron los primeros ataques de la enfermedad (Landa, B. B. et al. 2005. Plant Dis. 89:338). En España y Francia, los ataques de Mildiu en los campos comerciales de adormidera son causados por el oomiceto biotrofo obligado Peronospora arborescens (Landa, B. B. et al. 2005. Plant Dis. 89:338, Montes-Borrego, M. et al. 2008. Plant Dis. 92:834), mientras que Australia se ha identificado a Peronospora cristata como el agente causal de la enfermedad (Scott, J. B. et al. 2004. Mycol. Res. 108:198-295).

La detección exacta y la identificación apropiada del agente causal son esenciales para el control eficaz de una enfermedad de plantas. Durante los últimos 15 años han surgido técnicas moleculares basadas principalmente en ensayos convencionales de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) como principal herramienta para diagnosticar e identificar hongos fitopatógenos, que han contribuido a mitigar algunos de los problemas asociados con la detección, el control y la contención de patógenos de plantas (Henson, J.M. et al. 1993. Annu. Rev. Phytopathol. 31:81-109). Gracias a esta tecnología, recientemente se han realizado progresos considerables en el desarrollo de protocolos moleculares para la detección de P. arborescens en diferentes tejidos vegetales (Landa, B. B. et al.; 2007. Phytopathology 97:1380-1390, Montes-Borrego, M. et al. 2009; Phytopathology 99:73-81). En un trabajo reciente (Landa, B. B. et al.; 2007. Phytopathology 97:1380-1390) se ha desarrollado un protocolo de PCR simple específico de P. arborescens usando cualesquiera de dos conjuntos de pares de cebadores (OMPac1fw/OMPac1rv y OMPac7fw/OMPac7rv) que: (i) puede usarse para la detección de patógenos en cápsulas, hojas, raíces, semillas y tallos de plantas de adormidera; (ii) es lo bastante sensible como para detectar de 0,1 a 10 pg de ADN de P. arborescens; y (iii) es altamente específico ya que no se produce la amplificación cruzada con otros patógenos estrechamente relacionados en tejidos infectados de adormidera, especialmente de P. cristata. Posteriormente, se ha logrado una mejora significativa para la detección in planta de ADN de P. arborescens mediante un protocolo de PCR anidada desarrollado recientemente (Montes-Borrego, M. et al. 2009; Phytopathology 99:73-81) que tiene una sensibilidad de 2 a 3 órdenes de magnitud superior en comparación con la del ensayo de PCR simple usando los mismos cebadores, mientras que se mantienen las propiedades de este último ensayo. Ese aumento de la sensibilidad del protocolo de PCR anidada permitió la detección de tan sólo de 5 a 0,5 fg de ADN de P. arborescens en un fondo de 25 a 50 ng de ADN de adormidera.

Una de las limitaciones de los protocolos de PCR desarrollados radica en que no permiten cuantificar el nivel de infección en la planta por el patógeno. Un método de PCR cuantitativo y sensible sería particularmente útil para realizar estudios epidemiológicos y el diseño de estrategias de control de enfermedades y cuarentena, particularmente para: (i) identificar la existencia de germoplasma de adormidera resistente o tolerante mediante la cuantificación del patógeno en infecciones sintomáticas y asintomáticas; (ii) establecer una correlación entre la cantidad de enfermedad que puede desarrollarse a partir del uso de lotes de semillas comerciales con la cantidad de patógeno cuantificada en las mismas, que ayudaría a evitar el uso de lotes de semillas que representan un riesgo potencial para el desarrollo de epidemias; y (iii) correlacionar la cantidad de patógeno en tejidos vegetales infectados con el nivel de desarrollo de la enfermedad y/o expresión de síntomas posterior tras el uso de medidas de control de enfermedades (biológicas, químicas o físicas).

La PCR cuantitativa (qPCR) en tiempo real se introdujo en la monitorización de patógenos de plantas directamente a partir de tejidos vegetales a finales de los años 90, y desde entonces se ha adaptado para su uso en muchos sistemas de plantas-patógenos, incluyendo varios oomicetos, hongos, bacterias, nemátodos y virus patógenos de plantas (véase, por ejemplo, Schena, L., et al. 2004. Eur. J. Plant Pathol. 110: 893-908). En el caso de los oomicetos, la mayoría de los ensayos de qPCR se han desarrollado para diferentes especies de Pythium (Atallah, Z. K., y W. R. Stevenson. 2006. Phytopathology 96:1037-1045) y Phytophthora (Atallah, Z. K., y W. R. Stevenson. 2006. Phytopathology 96:1037-1045, Avrova, A. et al. 2003. Fung. Genet. Biol. 40:4-14). Además, se han desarrollado algunos ensayos de qPCR para los oomicetos biotrofos obligados como Plasmopara viticola (Valsesia, G et al. 2005. Phytopathology 95:672-678) y para algunas especies de Peronospora, incluyendo P. sparsa (Hukkanen, A et al. 2006. Eur. J. Plant Pathol. 116:225-235) y P. parasitica (Brouwer, M. et al. 2003. FEMS Microbiol. Lett. 228:241-248). La identificación y la detección a través de qPCR en tiempo real puede ser útil para resolver problemas derivados de la naturaleza de la biotrofia estricta de Peronospora spp., relacionados principalmente con la imposibilidad de aislar el patógeno a partir de tejidos infectados y del cultivo convencional in vitro.

La química de los ensayos qPCR en tiempo real utilizados para la detección y el estudio de microorganismos fitopatógenos puede agruparse en métodos no específicos de secuencia (Schroeder, K. L. et al. 2006. Phytopathology 96:637-647) y en métodos específicos de secuencia (TaqMan, Molecular Beacons, Scorpion-PCR, etc.) (Valsesia, G et al. 2005. Phytopathology 95:672-678) de amplicones. La química específica de secuencia es más específica pero aumenta el coste del análisis cuando se usan esos métodos de un modo generalizado y práctico. El uso del colorante fluorescente SYBR Green I para la detección de amplicones es un método bueno y fiable si los cebadores específicos están bien diseñados; pero de manera más importante, es probablemente la opción más económica en comparación con otras técnicas, permitiendo de ese modo realizar un número superior de ensayos de qPCR para aplicaciones prácticas en estudios de campo.

En la qPCR en tiempo real, cada reacción está caracterizada por un número de ciclos específico, el ciclo umbral (C_T), en el que puede detectarse un aumento estadísticamente significativo de la fluorescencia por encima del nivel inicial. El C_T es inversamente proporcional al logaritmo de la concentración de la secuencia diana. Esto significa que cuanto más molde esté presente en una muestra de PCR menor es el número de ciclos... [Seguir leyendo]

1. Un método para la cuantificación de Peronospora arborescens por PCR cuantitativa en una muestra biológica, que comprende:

2. Método según la reivindicación 1, en el que dicha muestra biológica es una muestra de material vegetal, o una muestra de estructuras de P. arborescens.

3. Método según la reivindicación 2, en el que dicha muestra de material vegetal se selecciona entre tejidos de semillas, cubiertas de semillas, hojas, tallos, cápsulas, raíces y mezclas de las mismas.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha muestra biológica está infectada por P. arborescens.

5. Método según la reivindicación 2, en el que dicha muestra de estructuras de P. arborescens contiene micelio, esporangios, esporangióforos u oosporas.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha muestra biológica procede de Papaver somniferum.

7. Empleo de una pareja de oligonucleótidos cuya secuencia de nucleótidos se muestra en SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 en una reacción de amplificación por PCR cuantitativa para cuantificar la presencia de Peronospora arborescens en una muestra biológica.

8. Empleo de la pareja de oligonucleótidos según la reivindicación 7, en el que dicha muestra biológica es una muestra de material vegetal, o una muestra de estructuras de P. arborescens.

9. Empleo de la pareja de oligonucleótidos según la reivindicación 7, en el que dicha muestra biológica es (i) una muestra de material vegetal, o (ii) una muestra de estructuras de P. arborescens.

10. Empleo según la reivindicación 8, en el que dicha muestra de material vegetal se selecciona entre tejidos de semillas, cubiertas de semillas, hojas, tallos, cápsulas, raíces y mezclas de las mismas.

11. Empleo según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en el que dicha muestra biológica está infectada por P. arborescens.

12. Empleo según la reivindicación 8, en el que la muestra de estructuras de P. arborescens contiene micelio, esporangios, esporangióforos u oosporas.