MÉTODO PARA LA DETECCIÓN DEL CÁNCER HEPÁTICO, DEL RIESGO DE CÁNCER HEPÁTICO, DEL RIESGO DE RECURRENCIA DEL CÁNCER HEPÁTICO, DE LA MALIGNIDAD DEL CÁNCER HEPÁTICO Y DE LA PROGRESIÓN EN EL TIEMPO DEL CÁNCER HEPÁTICO BASADO EN LA CITOSINA METILADA DEL GEN BASP1.

Método para la detección del cáncer hepático, del riesgo de cáncer hepático, del riesgo de recurrencia del cáncer hepático, de la malignidad del cáncer hepático y de la progresión en el tiempo del cáncer hepático basado en la citosina metilada del gen BASP1. SECTOR TÉCNICO DE LA INVENCIÓN La presente invención da a conocer un método, un kit y un reactivo para detectar el cáncer hepático, el riesgo de cáncer hepático, el riesgo de recurrencia del cáncer hepático, y la malignidad del cáncer hepático, y para monitorizar la progresión en el tiempo del cáncer hepático mediante la identificación y/o cuantificación de la metilación de genes concretos y/o de sus fragmentos de ADN en muestras clínicas. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN ES 2 365 829 T3 El cáncer hepático se desarrolla a partir de las enfermedades hepáticas crónicas (hepatitis crónica y cirrosis hepática), y en la mayoría de casos en aquellos pacientes con infección persistente por virus de la hepatitis. En Japón más del 95% de los pacientes con cáncer hepático presentan una infección mantenida por el virus de la hepatitis B (VHB) y hepatitis C (VHC), especialmente más del 80% de los casos derivan de enfermedades asociadas con el VHC. Generalmente, los pacientes con hepatitis alcanzan fases más graves 20-30 años después de la aparición de la hepatitis, y desarrollan el cáncer hepático tras la progresión a cirrosis hepática. Especialmente, la fase de pre-cirrosis hepática (fibrosis grado F3) y la cirrosis hepática (fibrosis grado F4) se asocian con tasas elevadas de cáncer hepático, y se dice que estos pacientes desarrollarán cáncer hepático en un período de 10 años. La edad de inicio es a los 60 años o más, con más casos en generaciones ancianas. Existen casos que se desarrollan en fases relativamente precoces y en generaciones más jóvenes tras la aparición de la hepatitis. Pero la causa es hasta la fecha desconocida. En el pasado, para detectar el cáncer hepático en pacientes de alto riesgo se realizaba periódicamente un cribado utilizando un ensayo inmunológico de los marcadores tumorales existentes, AFP (alfafetoproteína) y PIVKA-II (proteína inducida por la ausencia de vitamina K-II), y la monitorización mediante ecografía (ultrasonografía). Para los pacientes con sospecha de presentar un cáncer hepático mediante estas pruebas, la ubicación, tamaño y número de cáncer hepáticos se confirman mediante técnicas de diagnóstico por la imagen, ecografía más detallada, TC (tomografía computarizada) o RNM (resonancia nuclear magnética). Además, el cáncer hepático se diagnostica finalmente utilizando una prueba anatomopatológica mediante biopsia, si es necesario. Una vez diagnosticado definitivamente, el cáncer hepático se somete a tratamiento: hepatectomía, embolización trans-arterial (TAE), tratamiento por punción (terapia con inyección de etanol percutánea (PEIT), ablación con radiofrecuencia (RFA) o terapia de coagulación con microondas (MCT). Sin embargo, las tasas de recurrencia del cáncer hepático son extremadamente elevadas, dado que no se ha eliminado el virus y las enfermedades hepáticas no se han curado, aunque se hayan tratado. Si el cáncer hepático se detecta en una fase precoz (inferior a 3 cm de diámetro, inferior a 5 cm de diámetro y único o tumores bien diferenciados) mediante los ensayos inmunológicos y la ecografía actualmente utilizados, y se trata adecuadamente, el pronóstico es relativamente bueno. Sin embargo, la sensibilidad y especificidad de los marcadores tumorales existentes, AFP y PIVKA-II, utilizados para el ensayo inmunológico, son insuficientes. Especialmente, en el caso de carcinomas hepáticos de fases precoces ambos marcadores poseen una sensibilidad remarcablemente baja (ver literatura no patente 1, 2, 3 y 4). Por lo tanto, es difícil detectar el cáncer hepático en una fase precoz, la mayoría de casos ya han progresado a un cáncer avanzado cuando se detectan, y la tasa relativa de supervivencia a los 5 años de los pacientes con cáncer hepático es muy mala en comparación con otros cánceres (ver literatura no patente 5). Por otro lado, mejorías recientes en los instrumentos de ecografía nos han permitido detectar el cáncer hepático en fases precoces, pero no es adecuada para el cribado de pacientes de alto riesgo de cáncer hepático debido a algunos problemas como la necesidad de alrededor de 30 minutos para prueba, la necesidad de habilidades técnicas, la dependencia de las cualidades técnicas de los instrumentos, y que sigue teniendo una tasa de penetración baja en los hospitales generales. Además, dado que es difícil examinar todo el hígado, especialmente las partes ocultadas por otros órganos y completamente dentro del hígado, existe el riesgo de pasar por alto un cáncer hepático. Por lo tanto, no existen métodos suficientemente satisfactorios para la detección del cáncer hepático, especialmente en fases precoces. Los avances recientes de la biología molecular están clarificando las características de las modificaciones del ADN sin cambios genéticos y las alteraciones de las secuencias de nucleótidos en las células cancerosas humanas. Son bien conocidos, como ejemplos representativos, las características de los cambios, las mutaciones, la amplificación y la pérdida de genes. En estudios epigenéticos recientes, se ha notificado que genes concretos están altamente y anómalamente metilados en células variables, especialmente células cancerosas. En los eucariotas superiores, el ADN genómico está solamente metilado en los residuos citosina en dinucleótidos 2 CpG, la región CpG se denomina isla CpG y es conocido que existe en aproximadamente la mitad del genoma humano total. Generalmente, la isla CpG se encuentra en la región promotor, y en dicho caso la metilación está muy relacionada con la regulación de la expresión génica. Brevemente, en los casos no metilados los genes se expresan (el ARNm se transcribe), pero en los casos metilados está, por el contrario suprimida a través de algunos procesos del sistema de regulación. Es conocido que esta regulación de la expresión génica mediante la metilación es específica de tejido, desarrollo, diferenciación, enfermedad, sexo o edad. Especialmente, dado que la supresión de la expresión génica debida a una metilación anómala elevada de la isla CpG se observa frecuentemente en las células cancerosas o transformadas, se considera que está relacionada con la carcinogénesis. En base a estas evidencias de estudios básicos, hasta la fecha se han realizado estudios clínicos en diversos cánceres sobre la asociación entre la metilación anómala elevada de la isla CpG y la carcinogénesis. En el cáncer hepático se han realizado estudios clínicos similares, y se ha notificado que se observa una metilación anómala elevada de ciertos genes en tejidos tumorales de pacientes con cáncer hepático (ver literatura no patente 6, 7, y 8). La mayoría de desarrollos recientes, por ejemplo, la correlación positiva entre el fenotipo metilador de la isla CpG (CIMP) y los niveles de AFP en el carcinoma hepatocelular (HCC) sugieren que la CIMP puede servir como marcador molecular del desarrollo de HCC avanzado (ver literatura no patente 16) y que la hipermetilación de genes, por ejemplo, HAI-2/PB, se produce frecuentemente en tumores HCC primarios (ver literatura no patente 17). En consecuencia, se infiere que la utilización de la identificación de la metilación de genes concretos en células cancerosas o sus fragmentos de ADN como método diagnóstico es muy útil para la detección del cáncer en fases precoces. Además, la metilación que se considera uno de los factores directamente relacionados con la carcinogénesis, se supone que se desarrolla antes de la aparición del cáncer para alterar la progresión o alteración maligna del cáncer, y que muestra perfiles diferentes en diferentes pacientes o condiciones clínicas. Por lo tanto, la identificación de la metilación tiene posibilidades para permitir su utilización para la detección de lesiones precancerosas, la predicción de la recurrencia tras el tratamiento del cáncer hepático, la detección de la malignidad del cáncer hepático y la monitorización de la progresión en el tiempo del cáncer hepático. Sin embargo, los resultados anteriores de estudios clínicos se han obtenido utilizando ADN del tejido tumoral tras confirmación del diagnóstico en la muestra a analizar, y no puede cumplir con el uso como cribado para la detección del cáncer hepático en fases precoces o del riesgo de la aparición del cáncer hepático. Un ensayo que utiliza tejido no es adecuado para el análisis rutinario debido a que es de manipulación compleja y a la baja capacidad de procesamiento de muestras. Además, la sensibilidad y especificidad son insuficientes debido a una selección... [Seguir leyendo]

1. Método para detectar la presencia y/o cantidad de citosinas metiladas específicas del cáncer hepático en una región que contiene secuencias CpG en el gen BASP1 y opcionalmente en el gen SRD5A2 que comprende las siguientes etapas (a) a (d): (a) aislar el ADN genómico de una muestra del paciente; (b) poner en contacto un reactivo para el tratamiento químico o enzimático con el ADN genómico para discriminar entre citosinas metiladas y no metiladas; (c) amplificar una región que contiene citosinas metiladas del gen BASP1 y opcionalmente del gen SRD5A2 en el ADN genómico utilizando un método de PCR; y (d) determinar la presencia y/o cantidad de citosinas metiladas específicas del cáncer hepático en una región que contiene secuencias CpG del gen BASP1 y opcionalmente del gen SRD5A2 en la muestra de dicho paciente, de manera que la presencia y/o cantidad de citosinas metiladas específicas del cáncer hepático indican que el paciente está afecto de un cáncer hepático, presenta un riesgo aumentado de cáncer hepático, presenta un riesgo de recurrencia tras tratamiento del cáncer hepático, presenta un cáncer hepático maligno o presenta una cáncer hepático que está progresando en el tiempo. 2. Método para indicar que un paciente está afecto de de un cáncer hepático, presenta un riesgo aumentado de cáncer hepático, presenta un riesgo de recurrencia tras tratamiento del cáncer hepático, presenta un cáncer hepático maligno o presenta una cáncer hepático que está progresando en el tiempo mediante la detección de la presencia y/o cantidad de citosinas metiladas específicas del cáncer hepático en regiones que contienen secuencias CpG en al menos el gen BASP1 y el gen SPINT2, opcionalmente en un gen adicional entre los genes SRD5A2, CFTR, CCND2, APC y RASSF1 en la muestra de un paciente, comprendiendo dicho método las siguientes etapas (a) a (d): (a) aislar el ADN genómico de una muestra del paciente; (b) poner en contacto un reactivo para el tratamiento químico o enzimático con el ADN genómico para discriminar entre citosinas metiladas y no metiladas; (c) amplificar una región que contiene citosinas metiladas del gen BASP1 y del gen SPINT2, opcionalmente de un gen adicional entre los genes SRD5A2, CFTR, CCND2, APC y RASSF1 en el ADN genómico utilizando un método de PCR; y (d) determinar la presencia y/o cantidad de citosinas metiladas específicas del cáncer hepático en una región que contiene secuencias CpG del gen BASP1 y del gen SPINT2, y opcionalmente de un gen adicional entre los genes SRD5A2, CFTR, CCND2, APC y RASSF1 en la muestra del paciente. 3. Método, según las reivindicaciones 1 o 2, en el que al menos una secuencia de nucleótidos de un par de cebadores de PCR es complementaria a una secuencia de nucleótidos en una región que contiene residuos citosina que pueden metilarse del ADN genómico, hibridándose específicamente dicho cebador a dicha secuencia de nucleótidos del ADN genómico cuando dichas citosinas están metiladas. 4. Método, según las reivindicaciones 1 o 2, en el que se utilizan simultáneamente al menos un cebador de un par de cebadores de PCR que se hibrida específicamente a una región que no contiene residuos citosina que pueden ser metiladas y oligonucleótidos para bloquear la amplificación por dichos cebadores de PCR, en el que dichos oligonucleótidos se superponen parcialmente a las secuencias de nucleótidos de dichos cebadores de PCR, son complementarios a secuencias de nucleótidos en otras partes del ADN genómico en una región que contiene residuos que pueden metilarse y en el que dichos oligonucleótidos pueden hibridarse específicamente a dichas secuencias de nucleótidos del ADN genómico cuando dichas citosinas no están metiladas. 5. Método, según las reivindicaciones 1 o 2, en el que un par de cebadores puede hibridarse específicamente a secuencias de nucleótidos del ADN genómico que no contienen residuos citosina que puedan metilarse en al menos sus extremos 3, y en el que la determinación de la presencia y/o cantidad de citosinas metiladas en los productos según la etapa (d) se realiza mediante análisis de secuenciación o espectrometría de masas. 6. Método, según las reivindicaciones 1 o 2, en el que el tratamiento químico según la etapa (b) se realiza proporcionando al ADN genómico un reactivo para la conversión de las citosinas no metiladas a uracilos, de manera que esencialmente todas las citosinas no metiladas de dicho ADN se convierten a uracilos. 7. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que se determinan simultáneamente en la muestra las concentraciones de proteínas marcador tumoral convencionales como AFP y/o PIVKA-II y /o la cantidad de ADN libre circulante. 8. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el cáncer hepático es un cáncer hepático en fase precoz. 9. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la muestra deriva de suero, plasma, sangre total, tejidos, células sanguíneas, excreciones o secreciones internas/externas humanas. 10. Par de cebadores o grupo de cebadores que comprende los dos cebadores siguientes: 1) BASP1_MSF (Identificador de secuencia nº: 1) and BASP1_MSR (identificador de secuencia nº: 2), y opcionalmente al menos un par de cebadores seleccionados del siguiente grupo de pares de cebadores: 2) SPINT2_MSF (identificador de secuencia nº: 3) and SPINT2_MSR (identificador de secuencia nº: 4), 3) APC_MSF (identificador de secuencia nº: 5) and APC_MSR (identificador de secuencia nº: 6), 4) CCND2_MSF (identificador de secuencia nº: 7) and CCND2_MSR (identificador de secuencia nº: 8), 5) CFTR_MSF (identificador de secuencia nº: 9) and CFTR_MSR (identificador de secuencia nº: 10), 6) RASSF1_MSF (identificador de secuencia nº: 11 and RASSF1_MSR (identificador de secuencia nº: 12), y 7) SRDSA2_MSF (identificador de secuencia nº: 13) and SRD5A2_MSR (identificador de secuencia nº: 14). 11. Sonda o combinación de sondas formada por: 1) BASP1_TMP (identificador de secuencia nº: 31), y opcionalmente al menos una sonda seleccionada del siguiente grupo de sondas: 2) SPINT2_TMP (identificador de secuencia nº: 32), 3) APC_TMP (identificador de secuencia nº: 33), 4) CCND2_TMP (identificador de secuencia nº: 34), 5) CFTR_TMP (identificador de secuencia nº: 35), 6) RASSF1_TMP (identificador de secuencia nº: 36), y 7) SRDSA2_TMP (identificador de secuencia nº: 37). 12. Kit para el método de detección del cáncer hepático, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, formado por: (a) un par de cebadores o una combinación de pares de cebadores formada por al menos el identificador de secuencia nº: 1 y el identificador de secuencia nº: 2 según la reivindicación 10 y/o (b) una sonda o combinación de sondas formada al menos por el identificador de secuencia nº: 31 según la reivindicación 11, y (c) reactivos para la extracción del ADN. ES 2 365 829 T3 13. Reactivo para el método de detección del cáncer hepático, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, formado por: (a) un par de cebadores o una combinación de pares de cebadores formada por al menos el identificador de secuencia nº: 1 y el identificador de secuencia nº: 2, según la reivindicación 10 y/o (b) una sonda o combinación de sondas formada al menos por el identificador de secuencia nº: 31 según la reivindicación 11, y 41 ES 2 365 829 T3 14. Utilización de un par de cebadores o un grupo de pares de cebadores formado por el identificador de secuencia nº: 1 y el identificador de secuencia nº: 2 o una sonda o combinación de sondas formada por el identificador de secuencia nº: 31, según las reivindicaciones 10 u 11, para detectar la presencia y/o cantidad de bases citosina metiladas específicas del cáncer hepático en una región que contiene secuencias CpG de un gen relacionado con el HCC en una muestra de un paciente, o para detectar un cáncer hepático, un riesgo aumentado de cáncer hepático, un riesgo de recurrencia tras tratamiento del cáncer hepático, un cáncer hepático maligno o para monitorizar que un paciente está desarrollando un cáncer hepático que está progresando en el tiempo. 42 ES 2 365 829 T3 43 ES 2 365 829 T3 44 ES 2 365 829 T3 ES 2 365 829 T3 46 ES 2 365 829 T3 47