Uso de un oligonucleótido que tiene la secuencia 5'-Xm-CG-Yn-3'para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la resistencia a esteroides adquirida y la resistencia a esteroides primaria en un paciente,

en el que X es A, T, C o G, Y es A, T, C o G; m = 1-100, n = 1-100 y en el que al menos un dinucleótido CG no está metilado y en el que dicho paciente está afectado por un estado inflamatorio

Método inmunoestimulante.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método inmunoestimulante. En particular, la presente invención se refiere a un método en el que un oligonucleótido que contiene al menos un dinucleótido CG no metilado se administra a un paciente dependiente de, o que no responde a, esteroides afectado por un estado inflamatorio.

Antecedentes

La inflamación es una enfermedad compleja que involucra muchos factores y tipos celulares. Desde una perspectiva de la enfermedad, muchos años de investigaciones han enseñado que los trastornos inflamatorios tales como asma, artritis reumatoide, colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn y otros tienen un perfil de citocinas inflamatorias definido. Estos perfiles son el resultado de la naturaleza de los linfocitos de respuesta. En otras palabras, la inflamación no puede considerarse como sólo "inflamación" si no más bien como diferentes enfermedades inflamatorias asociadas con diferentes citocinas secretadas que potencian la proliferación y la diferenciación de ciertas subpoblaciones de células T cooperadoras.

La naturaleza y la magnitud de una respuesta inmunitaria están dictadas ampliamente por el perfil del antígeno extraño al que se ha expuesto al sistema inmunitario. Este acontecimiento pone en marcha una serie de acontecimientos que finalmente conducen a la generación de inmunidad humoral y mediada por células. Estas dos funciones efectoras diferentes están provocados por la presencia de dos subpoblaciones de células T cooperadoras (véase la figura 1). Tal como también se indica, pueden diferenciarse diferentes enfermedades inflamatorias como que son o bien Th1 o bien Th2, dependiendo del perfil de citocinas observado.

En condiciones sanas "normales" existe un equilibrio delicado entre las citocinas proinflamatorias típicas de Th1 y las citocinas proinflamatorias típicas de Th2. Si se pierde este equilibrio, existirá una polarización dando como resultado inflamación de tipo Th1 o Th2 predominantemente y se producirá la manifestación clínica de la enfermedad.

Algunas formas más recientes de agentes terapéuticos ahora intentan restaurar el "equilibrio" por ejemplo en enfermedades de tipo Th1 reduciendo el perfil de citocinas de Th1 y de ese modo permiten que se produzca un perfil más de Th2 (Neurath et al, 1995; Mannon et al, 2004). Durante los últimos 5 años más o menos, muchos investigadores han demostrado tanto in vitro como in vivo la validez del uso de oligonucleótidos como agentes inmunoestimulantes en aplicaciones de inmunoterapia. La observación de que los oligonucleótidos con fosfodiéster e incluso con fosforotioato modificado pueden inducir la inmunoestimulación ha creado un interés creciente en desarrollar este efecto como una herramienta terapéutica.

El ADN bacteriano tiene efectos inmunoestimulantes que pueden activar células B y linfocitos citolíticos naturales, pero el ADN de vertebrados no (revisado en Krieg, 1998. Applied Oligonucleotide Technology, C. A. Stein y A. M. Krieg, (Eds.), John Wiley and Sons, Inc., Nueva York, NY, págs. 431-448). Ahora se entiende que estos efectos inmunoestimulantes del ADN bacteriano son el resultado de la presencia de dinucleótidos CpG no metilados, en contextos de bases particulares (motivos CpG), que son comunes en el ADN bacteriano, pero están metilados y subrepresentados en el ADN de vertebrados (Krieg et al, 1995). Los efectos inmunoestimulantes del ADN bacteriano pueden imitarse con oligodesoxinucleótidos (ODN) sintéticos que contienen estos motivos CpG. Tales ODN con CpG tienen efectos altamente estimulantes sobre leucocitos humanos y murinos, que inducen la proliferación de células B; la secreción de citocinas y de inmunoglobulinas; la actividad lítica de linfocitos citolíticos naturales (NK) y la secreción del IFN-gamma; y la activación de células dendríticas (CD) y otras células presentadoras de antígeno para expresar moléculas coestimulantes y secretar citocinas, especialmente las citocinas de tipo Th1 que son importantes en la promoción del desarrollo de respuestas de célula T de tipo Th1. Estos efectos inmunoestimulantes del ODN con CpG con esqueleto con fosfodiéster nativo son altamente específicos para CpG porque se reducen drásticamente los efectos si se metila el motivo CpG, se cambia por un GpC, o de lo contrario se elimina o se altera (Krieg et al, 1995 y Hartmann et al, 1999).

En estudios iniciales, se pensó que el motivo CpG inmunoestimulante seguía la fórmula purina-purina-CpG-pirimidina-pirimidina (Krieg et al, 1995; Pisetsky, 1996 y Hacker et al., 1998).

Actualmente existe una cantidad significativa de datos publicados que indican que los oligonucleótidos que contienen motivos CpG inducen ciertas citocinas, por ejemplo, las células humanas y de ratón responden a los oligonucleótidos con motivo CpG mediante la secreción potenciada de interferón-gamma (IFN-gamma) (Iho et al., 1999: Cowdery et al., 1996) IL-1, IL-6, TNF-alfa e IL-12 (Stacey et al., 1996; Jakob et al., 1998 y Sparwasser et al., 1998).

Debido a la naturaleza de las citocinas inducidas, se considera en gran parte que los oligonucleótidos que contienen CpG inducen un perfil de Th1 tanto in vitro como in vivo (Zimmermann et al., 1998; Kline, 2000).

Además de la presencia de motivos CpG, los investigadores también han observado que sintetizando oligonucleótidos con un esqueleto de fosforotioato (PS) resistente a nucleasa completo pueden potenciarse los efectos estimulantes de los oligonucleótidos, porque estos oligonucleótidos fueron mucho más potentes al estimular células B, mientras que la misma secuencia con esqueleto de fosfodiéster nativo no tuvo ningún efecto (Zhao et al., 1996).

Aunque la presencia de un motivo CpG dentro de la secuencia de un oligonucleótido puede inducir una respuesta fuerte a citocinas de Th1, debe considerarse esta respuesta en el contexto global del estado de los compuestos de la modificación química así como la estructura de secuencia general.

Tal como ya se indicó en la introducción de los antecedentes a la inflamación, existe un perfil de citocinas especifico que se vuelve prominente en diversos tipos de enfermedades inflamatorias. Por ejemplo en pacientes asmáticos existen niveles altos de IL-4 y niveles bajos de IFN-gamma. Esta situación de citocinas indicará que el asma es un tipo Th2 de enfermedad. La artritis reumatoide por el contrario se asocia mejor con un tipo Th1 de inflamación caracterizado porque se observan niveles altos de IFN-gamma y niveles bajos de IL-4.

El fenómeno de resistencia a corticosteroides se ha estudiado más extensamente en pacientes asmáticos y con un menor grado en colitis ulcerosa en el que se han acumulado evidencias a lo largo de los años, que apuntan a varias anomalías de citocinas. Ambas enfermedades se clasifican como de tipo Th2 y se han implicado interferones así como IL-10 como que son factores importantes en la patogénesis de la resistencia a corticosteroides.

Puede ser posible que los oligonucleótidos inmunoestimulantes que pueden inducir la producción endógena de tales citocinas, tales como interferones e IL-10, puedan influir en el estado inflamatorio de pacientes con resistencia a esteroides o dependientes de esteroides de manera beneficiosa.

La evidencia de que ciertas citocinas pueden influir en la sensibilidad a esteroides se recoge de estudios clínicos realizados en pacientes con colitis ulcerosa y asmáticos resistentes a corticosteroides que también estaban todos en terapias con corticosteroides. De hecho, este tipo de característica del subgrupo de pacientes fue el único denominador común entre los estudios clínicos descritos a continuación.

Los interferones (IFN) desempeñan papeles cruciales en la regulación de una amplia variedad de respuestas inmunitarias innatas y adaptativas. Los interferones de tipo I (IFN-alfa/beta) son fundamentales para la defensa del huésped frente a patógenos tales como virus, mientras que el interferón de tipo II (IFN-gamma) contribuye principalmente a la regulación mediada por células T de las respuestas inmunitarias (Taniguchi y Takaoka, 2001). Los interferones también han encontrado su lugar en el tratamiento satisfactorio de diversas enfermedades humanas tales como enfermedades neoplásicas benignas (Gili et al, 1995) y virales (Niederau et al, 1996; Zeuzem et al, 2000).

En...

1. Uso de un oligonucleótido que tiene la secuencia

5'-X_m-CG-Y_n-3'

para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la resistencia a esteroides adquirida y la resistencia a esteroides primaria en un paciente, en el que X es A, T, C o G, Y es A, T, C o G; m = 1-100, n = 1-100 y en el que al menos un dinucleótido CG no está metilado y en el que dicho paciente está afectado por un estado inflamatorio.

2. Uso según la reivindicación 1, en el que m es 1-80 y n es 1-80.

3. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en el que m es 1-60 y n es 1-60.

4. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que m es 1-40 y n es 1-40.

5. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que m es 1-20 y n es 1-20.

6. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que m es 1-12 y n es 1-12.

7. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que m es 1-10 y n es 1-10.

8. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que m es 1-8 y n es 1-8.

9. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que m es 1-6 y n es 1-6.

10. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que m es 1-4 y n es 1-4.

11. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que m es 1-2 y n es 1-2.

12. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho paciente está actualmente en tratamiento con esteroides.

13. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho paciente es dependiente de esteroides y está actualmente en tratamiento con esteroides.

14. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho paciente está actualmente en tratamiento antiinflamatorio.

15. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el estado inflamatorio se selecciona del grupo que consiste en colitis ulcerosa (CU), enfermedad de Crohn (EC), artritis reumatoide, psoriasis, enfisema, asma y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC).

16. Uso según la reivindicación 15, en el que el estado inflamatorio es colitis ulcerosa.

17. Uso según la reivindicación 15, en el que el estado inflamatorio es enfermedad de Crohn.

18. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el oligonucleótido comprende al menos un nucleótido que tiene una modificación del esqueleto.

19. Uso según la reivindicación 18, en el que la modificación del esqueleto es una modificación del esqueleto de fosfato.

20. Uso según la reivindicación 19, en el que la modificación del esqueleto de fosfato es una modificación con fosforotioato o fosforoditioato.

21. Uso según la reivindicación 19, en el que la modificación del esqueleto de fosfato está comprendida en los enlaces entre nucleótidos en 5' o en los enlaces entre nucleótidos en 3'.

22. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho oligonucleótido es un oligonucleótido compuesto por ADN o un análogo o imitador de ADN seleccionado del grupo que consiste en metilfosfonato, N3'->P5'-fosforamidato, morfolino, ácido nucleico peptídico (PNA), ácido nucleico cerrado (LNA), ácido nucleico con arabinosilo (ANA), ácido nucleico con fluoro-arabinosilo (FANA) y ácido nucleico con metoxi- etilo (MOE).

23. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho oligonucleótido comprende al menos una nucleobase con resto de azúcar modificado.

24. Uso según la reivindicación 23, en el que el resto de azúcar modificado es un resto de 2'-O-metoxietil-azúcar.

25. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el oligonucleótido se administra en combinación con esteroides.

26. Oligonucleótido que tiene la secuencia

5'-X_m-CG-Y_n-3'

para su uso en el tratamiento de la resistencia a esteroides adquirida y la resistencia a esteroides primaria en un paciente, en el que X es A, T, C o G, Y es A, T, C o G; m = 1-100, n = 1-100 y en el que al menos un dinucleótido CG no está metilado y en el que dicho paciente está afectado por un estado inflamatorio.