El uso de un polinucleótido que codifica una luciferasa de Renilla secretada,

en la fabricación de un agente farmacéutico para prevenir, retrasar el inicio de o tratar diabetes en un paciente, estando el agente farmacéutico formulado para administración en un tratamiento que comprende: a) seleccionar un paciente que tenga predisposición a desarrollar diabetes, que esté desarrollando diabetes o que sea diabético: b) administrar al paciente una o más de una dosis del agente farmacéutico

Esta invención se realizó con el apoyo del Gobierno de los Estados Unidos bajo el Acuerdo de Cooperación Número DAMD 17-97-2-7016 con el National Medical Technology Testbed, Inc., Departamento del Ejército de los Estados Unidos. El Gobierno de los Estados Unidos ostenta ciertos 5 derechos sobre esta invención.

ANTECEDENTES

La diabetes es una causa principal de morbilidad y mortalidad en los Estados Unidos y en todo el mundo. La diabetes es una enfermedad metabólica caracterizada por la incapacidad de metabolizar glucosa y se divide generalmente en dos tipos. De los dos tipos, la diabetes de tipo 1 habitualmente es el 10 resultado de la destrucción autoinmune de células en el páncreas durante la adolescencia, lo que conduce a una producción de insulina insuficiente.

La investigación de las causas y tratamientos para la diabetes de tipo 1 implica frecuentemente el uso de animales no humanos. El de ratón diabético no obeso (NOD) es un sistema de modelo animal aceptado generalmente para estudiar la diabetes de tipo 1, ya que los ratones NOD desarrollan una forma 15 de diabetes que es paralela a la diabetes de tipo 1 en seres humanos, incluyendo el compartir factores comunes de predisposición, tales como moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad. Los estudios de ratones NOD y seres humanos han indicado que dos proteínas sintetizadas por células beta pancreáticas desempeñan papeles determinantes como autoantígenos responsables del inicio de la diabetes. Las dos proteínas son la hormona insulina, una proteína secretada, y la enzima ácido glutámico 20 descarboxilasa (GAD), una proteína intracelular que se encuentra como GAD67 soluble, o GAD65 unida a la membrana en las células beta. La importancia de estos dos autoantígenos para el inicio de la diabetes en ratones NOD es indicada por el descubrimiento de que la mayoría de las células T CD8+ patógenas reconocen un único epítopo de insulina, y que los ratones con expresión reducida de genes gad65/67 específica de células beta no desarrollan diabetes. En seres humanos, la presencia de autoanticuerpos 25 anti-insulina y anti-GAD se ha usando para predecir el inicio de la diabetes. Sigue existiendo, sin embargo, una necesidad de un método de prevención de la diabetes en seres humanos.

SUMARIO

De acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para prevenir, retrasar el inicio de o tratar la diabetes en un paciente. El método comprende, en primer lugar, seleccionar un paciente que 30 tenga predisposición a desarrollar diabetes, que esté desarrollando diabetes o que sea diabético. A continuación, al paciente se le administra una o más de una dosis de un agente farmacéutico que comprende un polinucleótido que codifica una luciferasa de Renilla exógena secretada.

En una realización preferida, la selección del paciente comprende identificar en el paciente la presencia de autoanticuerpos anti-insulina o anti-GAD, o identificar en el paciente la presencia de 35 hiperglucemia en aumento, o identificar en el paciente la presencia de glucosuria, o identificar en el paciente la presencia de una predisposición genética a la diabetes. En una realización particularmente preferida, la una o más de una dosis es una pluralidad de dosis. En otra realización particularmente preferida, administrar al paciente una o más de una dosis comprende inyectar al paciente por vía intramuscular la una o más de una dosis. En otra realización preferida, el método comprende, después de 40 la administración, supervisar al paciente para detectar el desarrollo de la diabetes.

En una realización particularmente preferida, la proteína exógena es una luciferasa de Renilla secretada que comprende una secuencia de acuerdo con la SEC ID Nº 1.

FIGURAS

Éstas y otras características, aspectos y ventajas de la presente invención se entenderán mejor 45 en relación con la siguiente descripción, reivindicaciones adjuntas, y la figura adjunta, en la que:

La figura 1 es un gráfico que muestra el porcentaje de ratones NOD tratados con ciclofosfamida, no diabéticos dado frente al tiempo, donde a los ratones NOD se les inyectó ADN plasmídico que codifica GAD65 humana de longitud completa (cuadros rellenos); SGAD55, una forma secretada de GAD65 humana (cuadros vacíos); SRUC3, una forma secretada de la luciferasa de Renilla reniformis 50 (círculos vacíos); o ninguna inyección de ADN plasmídico (círculos rellenos).

DESCRIPCIÓN

De acuerdo con una realización de la presente invención, se proporciona un método para retrasar el inicio de diabetes de tipo 1 o prevenir diabetes de tipo 1 en un ser humano o animal. El método comprende seleccionar un paciente que tenga predisposición a desarrollar diabetes o que esté 55 desarrollando diabetes y administrar al paciente una o más de una dosis de un agente farmacéutico. El agente farmacéutico puede comprender un polinucleótido que codifica una luciferasa de Renilla secretada

o puede comprender un polinucleótido que codifica una forma secretada de ácido glutámico descarboxilasa.

La presente invención es el resultado de una investigación de diabetes acelerada por ciclofosfamida en ratones diabéticos no obesos (NOD) a los que se administró ADN plasmídico que codifica GAD humana intracelular, una forma secretada de GAD humana o una forma secretada de 5 luciferasa de Renilla reniformis. En resumen, a animales de cuatro semanas de edad se les inyectó ADN plasmídico que codifica GAD humana intracelular, una forma secretada de GAD humana o una forma secretada de luciferasa de Renilla reniformis. Los animales a los que se inyectó ADN plasmídico que codifica GAD secretada demostraron una reducción significativa de la incidencia de la diabetes. Los animales a los que se inyectó ADN plasmídico que codifica luciferasa de Renilla reniformis demostraron 10 un retraso significativo del inicio de la diabetes. Sin embargo, los animales a los que se inyectó ADN plasmídico que codifica GAD intracelular no demostraron ni una reducción significativa de la incidencia de la diabetes ni un retraso significativo del inicio de la diabetes, incluso aunque estudios previos mostraban que la inyección de ADN plasmídico que codifica GAD65 humana o una GAD secretada impedía la inflamación de los islotes (insulitis) en el páncreas de ratones NOD. La presente invención se describirá a 15 continuación en detalle.

En primer lugar, los plásmidos denominados pND2-SRUC3, pND2-GAD65 y pND2-SGAD55 se construyeron como se describe en el documento Liu, J. et al. (1999). Intramuscular injection of plasmid DNA encoding intracellular or secreted glutamic acid decarboxylase causes decreased insulitis in the non-obese diabetic mouse. Gene Ther. Mol. Biol. 3, 197-206. Los ADNc portados por los plásmidos eran 20 respectivamente; sruc3, SEC ID Nº 1, que codifica una forma secretada de la luciferasa del coral blando Renilla reniformis; gad65, SEC ID Nº 2, que codifica la proteína GAD65 humana de longitud completa; y sgad55, SEC ID Nº 3, un ADNc de gad65 modificado que codifica una forma truncada secretada de GAD65 humana, SEC ID Nº 2, que tenía una deleción en la región amino-terminal de 88 aminoácidos que elimina una secuencia de palmitoilación y una señal que fija como objetivo el aparato Golgi, que impide la 25 secreción de la proteína GAD65 de longitud completa, dejando los restos 265-1758 de SEC ID Nº 2. La secuencia delecionada se sustituyó por una secuencia de IL-2 humana que codifica un péptido señal, que se escindió de manera intracelular antes de la secreción. Esta proteína GAD65 truncada (GAD55) contenía todos los epítopos reconocidos por anticuerpos de pacientes que padecen diabetes de tipo 1. Cada ADNc se colocó bajo el control transcripcional del promotor de citomegalovirus en el plásmido 30 pND2. Además, cada plásmido portaba un origen de replicación CoL-E1 y un gen que codifica resistencia a ampicilina para la amplificación de ADN plasmídico en la bacteria Escherichia coli.

El ADN plasmídico se amplificó en la cepa de E. coli DH5-a, y se aisló usando el método de lisis alcalina seguido de una purificación doble con cloruro de cesio convencional. La calidad y cantidad del ADN se determinaron con un espectrofotómetro U.V. (proporción A260/A280 mayor de 1,8), y electroforesis 35 en gel de agarosa. El ADN plasmídico se disolvió a continuación en condiciones estériles en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a una concentración final de 2 g/l, y se almacenó a -20ºC.

El ADN...

1. El uso de un polinucleótido que codifica una luciferasa de Renilla secretada, en la fabricación de un agente farmacéutico para prevenir, retrasar el inicio de o tratar diabetes en un paciente, estando el agente farmacéutico formulado para administración en un tratamiento que comprende:

a) seleccionar un paciente que tenga predisposición a desarrollar diabetes, que esté desarrollando 5 diabetes o que sea diabético:

b) administrar al paciente una o más de una dosis del agente farmacéutico.

2. El uso de la reivindicación 1, en el que la selección del paciente comprende identificar en el paciente la presencia de:

i) autoanticuerpos anti-insulina o anti-GAD o autoanticuerpos anti-insulina y anti-GAD, o 10

ii) hiperglucemia en aumento, o

iii) glucosuria, o

iv) una predisposición genética a la diabetes.

3. El uso de la reivindicación 1, en el que la una o más de una dosis es una pluralidad de dosis.

4. El uso de la reivindicación 1, en el que administrar al paciente una o más de una dosis 15 comprende inyectar al paciente por vía intramuscular la una o más de una dosis.

5. El uso de la reivindicación 1, en el que la luciferasa de Renilla secretada comprende una secuencia de acuerdo con la SEC ID Nº 1.

6. El uso de la reivindicación 1, en el que el tratamiento comprende además, después de la administración, supervisar al paciente para detectar el desarrollo de la diabetes. 20