Transfección mediada por células apoptóticas de células de mamífero con ARN de interferencia.

Método para transfectar una célula de mamífero in vitro comprendiendo el método:



(a) proporcionar una célula de mamífero que exprese un gen diana, estando la célula de mamífero viva y siendo capaz de fagocitosis; y

(b) exponer la célula de mamífero viva a una composición que comprende una célula apoptótica, comprendiendo la célula apoptótica un antígeno y una molécula de ARNi, usándose la célula apoptótica como un vehículo de suministro para la molécula de ARNi, siendo capaz la molécula de ARNi de regular negativamente el gen diana en la célula de mamífero viva, en condiciones por las que la célula apoptótica se capta por la célula de mamífero viva.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2007/079876.

Solicitante: LOMA LINDA UNIVERSITY.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 24888 PROSPECT STREET LOMA LINDA, CA 92350 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: ESCHER, ALAN P., LI, FENGCHUN.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12N15/11 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Fragmentos de ADN o de ARN; sus formas modificadas (ADN o ARN no empleado en tecnología de recombinación C07H 21/00).
  • C12N15/113 C12N 15/00 […] › Acidos nucleicos no codificantes que modulan la expresión de genes, p.ej. oligonucleótidos antisentido.
  • C12N15/87 C12N 15/00 […] › Introducción de material genético extraño utilizando procedimientos no previstos en otro lugar, p. ej. cotransformación.

PDF original: ES-2385204_T3.pdf

 

Transfección mediada por células apoptóticas de células de mamífero con ARN de interferencia.

Fragmento de la descripción:

Transfección mediada por células apoptóticas de células de mamífero con ARN de interferencia.

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos 60/827.323, titulada “Apoptotic cell-mediated transfection of mammalian cells with interfering RNA” presentada el 28 de septiembre de 2006.

Antecedentes

La interferencia con ARN (iARN) es un mecanismo de biología molecular en el que la presencia de ciertos fragmentos de ARN bicatenario (ARNbc) interfiere con la expresión de un gen particular, que comparte una secuencia homóloga con el ARNbc. iARN es un proceso de silenciamiento génico que requiere la participación activa de maquinaria celular. Aunque el mecanismo específico se entiende escasamente, se sabe que la enzima ribonucleasa Dicer se une a y escinde moléculas de ARN bicatenario (ARNbc) cortas para producir fragmentos bicatenarios de 21-23 pares de bases con salientes monocatenarios de dos bases en cada extremo. Los fragmentos bicatenarios cortos producidos por Dicer, llamados ARN de interferencia pequeños (ARNip) , se separan después, supuestamente por una enzima con actividad helicasa, y se integran en un complejo multiproteico denominado complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) .

Los ARNip sintéticos y ARN en horquilla cortos (ARNhc) pueden diseñarse para tener función idéntica. Mientras que un ARNip son dos hebras de ARN complementario que pueden sintetizarse, un ARNhc se codifica por ADN como una molécula de ARN sencilla que hibrida consigo misma con un bucle en un extremo. El bucle se escinde después de forma intracelular produciendo una molécula similar a un ARNip. Existen miles de secuencias de ARNi que son capaces de regular negativamente la expresión génica (véase, por ejemplo, Behlke, 2006, Mol Ther vol. 13 p 644) . Este método se ha convertido en un medio universalmente aceptado de regulación negativa de la expresión de cualquier gen en células de mamífero.

En la actualidad, se suministran moléculas de ARNi mediante electroporación, transfección mediada por cationes y liposomas, suministro viral e inyección directa (Behlke, 2006, Mol Ther vol. 13 p644) . Un grupo ha mostrado que pueden usarse bacterias para suministrar moléculas de ARNi a células de mamífero para explorar con respecto a moléculas de ARNip de dirección (Zhao et al., 2005, Nat Methods vol 2 p 967) .

Las células presentadoras de antígeno (APC) como células dendríticas (DC) son una diana principal para manipulación de respuestas inmunes y se ha modificado usando ARNi (Li et al., 2004, Immu Res vol 30 p 215) . Sin embargo, no hay ningún método disponible que permita el cosuministro garantizado de múltiples antígenos y moléculas de ARNi a las mismas APC.

El documento US-A1-2002/031521 describe un procedimiento para transferir ADN genómico a células de mamífero por medio de células apoptóticas y muestra que diferentes formas de ADN no son equivalentes, es decir el reemplazo de ADN genómico con ADN episomal no garantiza la transferencia de ADN por captación de células apoptóticas.

El documento WO-A2-2005/121369 describe experimentos que usan microvesículas preparadas a partir de células madre embrionarias para transferir ARNm de células madre a células receptoras de médula ósea; los inventores usaron microvesículas de células vivas, no de células apoptóticas.

LI M ET AL: "Induction of RNA interference in dendritic cells" IMMUNOLOGIC RESEARCH 2004 US, vol. 30, Nº 2, 2004, páginas 215-230, ISSN: 0257-277X describe el suministro de ARNip desnudo que se dirige a IL12p35 a DC murinas para manipular su función inmunológica.

Sumario

La invención utiliza células apoptóticas (AC) para el suministro a células vivas de ARN cortos capaces de regular negativamente la expresión génica mediante interferencia de ARN (iARN) . Se examina el problema de suministrar moléculas de ARNi a células de mamífero in vivo y la capacidad para ligar la presencia de un antígeno o antígenos ya sintetizados con una molécula de ARNi como pare del mismo conjunto para suministrar.

En un ejemplo se proporciona un método para generar AC que contengan una molécula de ARNi, que incluye las etapas de (1) proporcionar una molécula de ARNi, tal como ARN de interferencia corto (ARNip) o un vector capaz de expresar un ARN en horquilla corto (ARNhc) , dirigido a un gen diana de interés; (2) introducir la molécula de ARNi en células preapoptóticas (pre-AC) , preferiblemente por transfección; y (3) inducir apoptosis, por ejemplo, por exposición a UV o expresión de una proteína pro-apoptótica como BAX, para crear una AC que contenga la molécula de ARNi.

En un ejemplo la molécula de ARNi contiene una secuencia polinucleotídica sustancialmente complementaria a un ARN mensajero (ARNm) que codifica el gen diana. En una realización preferida la molécula de ARNi comprende un ARN bicatenario (ARNbc) , que contiene una secuencia sentido que corresponde a una secuencia parcial del ARNm de gen diana y una secuencia antisentido que es sustancialmente complementaria y capaz de hibridar específicamente con un ARNm de gen diana.

En un ejemplo, la molécula de ARNi comprende una molécula de ARN bicatenaria (ARNbc) corta de aproximadamente 19-27 pares de bases. En un ejemplo la molécula de ARNi es un ARNip, que comprende una molécula de ARN bicatenario (ARNbc) corta de aproximadamente 19-23 pares de bases, teniendo cada hebra un saliente monocatenario de aproximadamente dos bases en un extremo.

En otro ejemplo, la molécula de ARNi se proporciona por un vector capaz de expresar un ARN en horquilla corto (ARNhc) o un ARN de interferencia corto (ARNip) . En un ejemplo, el vector contiene uno o más de un promotor de ARN polimerasa III que controla la transcripción de la molécula de ARNi.

En un ejemplo, la molécula de ARNi se introduce en la célula de mamífero por transfección, electroporación o microinyección. En otro ejemplo, la molécula de ARNi se introduce en la célula de mamífero por suministro de un plásmido de ADN o vector viral que codifica un ARN en horquilla corto (ARNhc) .

En un ejemplo, el método incluye la etapa adicional de introducir un ADN plasmídico o vector de expresión viral que contiene una secuencia polinucleotídica que codifica una proteína proapoptótica, tal como proteína BAX, en las células de mamífero prepapoptóticas.

En un ejemplo la molécula de ARNi y el vector de expresión que contiene una secuencia polinucleotídica que codifica una proteína proapoptótica se introducen ambos en la célula de mamífero, por ejemplo por co-transfección in vitro o introduciendo la molécula de ARNi y el vector de expresión en un órgano o tejido por electroporación, pistola génica o inyección.

La presente invención proporciona un método para transfectar una célula de mamífero, que incluye las etapas de:

(a) proporcionar una célula de mamífero que expresa un gen diana, siendo capaz la célula de mamífero de fagocitosis; y (b) exponer la célula de mamífero a una célula apoptótica, que contiene una molécula de ARNi capaz de regular negativamente el gen diana, en condiciones por las que la célula apoptótica se capta por la célula de mamífero. La molécula de ARNi regula después negativamente la expresión del gen diana en la célula de mamífero. En realizaciones alternativas, las células de mamífero se exponen a las células apoptóticas in vivo o in vitro. En una realización preferida, la célula de mamífero es una célula presentadora de antígenos.

En otro ejemplo, se proporciona una célula huésped de mamífero, que comprende: (a) una o varias moléculas de ARNi capaces de regular negativamente un gen diana; y (b) un vector de expresión capaz de expresar una proteína proapoptótica. En una realización preferida la célula huésped de mamífero expresa uno o varios antígenos, como autoantígenos o antígenos donadores. Las células huésped de mamífero de acuerdo con este aspecto de la presente invención pueden convertirse a AC para su uso en procedimientos de transfección mediados por células.

Muchas células pueden procesar AC, en particular, células presentadoras de antígenos (APC) como células dendríticas (DC) que dirigen respuestas inmunes. La capacidad para suministrar antígeno y una molécula de ARNi capaz de modificar la función de una APC, como DC, como parte del mismo conjunto... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Método para transfectar una célula de mamífero in vitro comprendiendo el método:

(a) proporcionar una célula de mamífero que exprese un gen diana, estando la célula de mamífero viva y siendo capaz de fagocitosis; y

(b) exponer la célula de mamífero viva a una composición que comprende una célula apoptótica, comprendiendo la célula apoptótica un antígeno y una molécula de ARNi, usándose la célula apoptótica como un vehículo de suministro para la molécula de ARNi, siendo capaz la molécula de ARNi de regular negativamente el gen diana en la célula de mamífero viva, en condiciones por las que la célula apoptótica se capta por la célula de mamífero viva.

2. El método de la reivindicación 1, en el que la molécula de ARNi adquirida de la célula apoptótica regula negativamente la expresión del gen diana en la célula de mamífero viva.

3. El método de la reivindicación 1, en el que la célula de mamífero viva es una célula presentadora de antígenos.

4. El método de la reivindicación 1, en el que la célula de mamífero viva que expresa el gen diana es una primera célula de mamífero y la célula apoptótica que comprende un antígeno y una molécula de ARNi se genera por un método que comprende:

(a) proporcionar una molécula de ARNi, siendo la molécula de ARNi capaz de regular negativamente el gen diana de interés en la primera célula de mamífero;

(b) introducir la molécula de ARNi en una segunda célula de mamífero, no siendo la segunda célula de mamífero la misma que la primera célula de mamífero; y

(c) inducir apoptosis en la segunda célula de mamífero para crear una célula apoptótica que comprenda el antígeno y la molécula de ARNi.

5. El método de la reivindicación 1, en el que la molécula de ARNi es un ARN de interferencia corto (ARNip) o un ARN en horquilla corto (ARNhc) , siendo el ARNip una molécula de ARN bicatenario (ARNbc) corta de 19-23 pares de bases, teniendo cada hebra un saliente monocatenario de dos bases en un extremo.

6. El método de la reivindicación 1, en el que la molécula de ARNi contiene una secuencia polinucleotídica que es complementaria de un ARN mensajero (ARNm) que codifica el gen diana.

7. El método de la reivindicación 1, en el que la molécula de ARNi comprende un ARN bicatenario (ARNbc) , comprendiendo el ARNbc una secuencia sentido correspondiente a una secuencia parcial del ARNm del gen diana y una secuencia antisentido que es complementaria de y capaz de hibridar específicamente con un ARNm del gen diana.

8. El método de la reivindicación 1, en el que la molécula de ARNi comprende una molécula de ARN bicatenario (ARNbc) corta de 19-27 pares de bases.

9. El método de la reivindicación 4, en el que la molécula de ARNi se proporciona por un vector capaz de expresar un ARN en horquilla corto (ARNhc) o un ARN de interferencia corto (ARNip) , conteniendo el vector uno o más de un promotor de ARN polimerasa III que controla la transcripción de la molécula de ARNi.

10. El método de la reivindicación 4, en el que la molécula de ARNi se introduce en la segunda célula de mamífero por transfección, electroporación o microinyección.

11. El método de la reivindicación 4, en el que la molécula de ARNi se introduce en la segunda célula de mamífero suministrando un plásmido de ADN o vector viral que codifica un ARN en horquilla corto (ARNhc) .

12. El método de la reivindicación 4, en el que se induce apoptosis exponiendo la segunda célula de mamífero que contiene la molécula de ARNi a luz ultravioleta.

13. El método de la reivindicación 4, en el que se induce apoptosis por expresión de una proteína pro-apoptótica.

14. El método de la reivindicación 4, que comprende adicionalmente introducir un ADN plasmídico o vector de expresión viral que contiene una secuencia polinucleotídica que codifica una proteína pro-apoptótica en la segunda célula de mamífero, siendo la proteína pro-apoptótica preferiblemente la proteína BAX.

15. El método de la reivindicación 14, en el que la molécula de ARNi se introduce en la célula de mamífero y se induce apoptosis in vitro, conteniendo la molécula de ARNi y el vector de expresión una secuencia polinucleotídica que codifica una proteína pro-apoptótica que se introduce preferiblemente en la célula de mamífero por cotransfección, o que se introduce en un órgano o tejido por electroporación, pistola génica o inyección.

16. Uso de una composición que comprende una célula apoptótica, comprendiendo la célula apoptótica un antígeno y una molécula de ARNi, usándose la célula apoptótica como un vehículo de suministro para la molécula de ARNi, siendo capaz la molécula de ARNi de regular negativamente el gen diana en la célula de mamífero viva, para llevar a cabo el método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en aplicaciones in vitro.

 

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