Transfección mediada por células apoptóticas de células de mamífero con ARN de interferencia.

Una célula de mamífero apoptótica o pre-apoptótica cultivada in vitro,

que comprende:

(a) una molécula de ARNi capaz de regular negativamente un gen diana; y

(b) un vector de expresión capaz de expresar una proteína pro-apoptótica,

para emplear en terapia.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E12159304.

Solicitante: LOMA LINDA UNIVERSITY.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 24888 PROSPECT STREET LOMA LINDA, CA 92350 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: ESCHER, ALAN P., LI, FENGCHUN.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • A61K31/713 SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE.A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L;   composiciones a base de jabón C11D). › A61K 31/00 Preparaciones medicinales que contienen ingredientes orgánicos activos. › Acidos nucleicos u oligonucleótidos con estructura en doble hélice.
  • A61K35/12 A61K […] › A61K 35/00 Preparaciones medicinales que contienen sustancias de constitución indeterminada o sus productos de reacción. › Sustancias procedentes de mamíferos; Composiciones que comprenden tejidos o células indeterminadas; Composiciones que comprenden células madre no embrionarias; Células modificadas genéticamente (células madre no caracterizadas A61K 35/545; vacunas o preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos A61K 39/00).
  • A61P37/06 A61 […] › A61P ACTIVIDAD TERAPEUTICA ESPECIFICA DE COMPUESTOS QUIMICOS O DE PREPARACIONES MEDICINALES.A61P 37/00 Medicamentos para el tratamiento de problemas inmunológicos o alérgicos. › Inmunosupresores, p. ej. medicamentos para el tratamiento del rechazo en injertos.
  • C12N15/11 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Fragmentos de ADN o de ARN; sus formas modificadas (ADN o ARN no empleado en tecnología de recombinación C07H 21/00).
  • C12N15/113 C12N 15/00 […] › Acidos nucleicos no codificantes que modulan la expresión de genes, p.ej. oligonucleótidos antisentido.

PDF original: ES-2537406_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Transfección mediada por células apoptóticas de células de mamífero con ARN de interferencia.

Antecedentes La interferencia con ARN (iARN) es un mecanismo de biología molecular en el que la presencia de ciertos fragmentos de ARN bicatenario (ARNbc) interfiere con la expresión de un gen particular, que comparte una 5 secuencia homóloga con el ARNbc. iARN es un proceso de silenciamiento génico que requiere la participación activa de maquinaria celular. Aunque el mecanismo específico se entiende escasamente, se sabe que la enzima ribonucleasa Dicer se une a y escinde moléculas de ARN bicatenario (ARNbc) cortas para producir fragmentos bicatenarios de 21-23 pares de bases con salientes monocatenarios de dos bases en cada extremo. Los fragmentos bicatenarios cortos producidos por Dicer, llamados ARN de interferencia pequeños (ARNip) , se separan después, 10 supuestamente por una enzima con actividad helicasa, y se integran en un complejo multiproteico denominado complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) .

Los ARNip sintéticos y ARN en horquilla cortos (ARNhc) pueden diseñarse para tener una función idéntica. Mientras que un ARNip son dos hebras de ARN complementario que pueden sintetizarse, un ARNhc se codifica por ADN como una molécula de ARN sencilla que hibrida consigo misma con un bucle en un extremo. El bucle se escinde 15 después de forma intracelular produciendo una molécula similar a un ARNip. Existen miles de secuencias de ARNi que son capaces de regular negativamente la expresión génica (véase, por ejemplo, Behlke, 2006, Mol Ther vol. 13 p 644) . Este método se ha convertido en un medio universalmente aceptado de regulación negativa de la expresión de cualquier gen en células de mamífero.

En la actualidad, se suministran moléculas de ARNi mediante electroporación, transfección mediada por cationes y 20 liposomas, suministro viral e inyección directa (Behlke, 2006, Mol Ther vol. 13 p644) . Un grupo ha mostrado que pueden usarse bacterias para suministrar moléculas de ARNi a células de mamífero para explorar con respecto a moléculas de ARNip de dirección (Zhao et al., 2005, Nat Methods vol 2 p 967) .

Las células presentadoras de antígeno (APC) como células dendríticas (DC) son una diana principal para manipulación de respuestas inmunes y se han modificado usando ARNi (Li et al., 2004, Immu Res vol 30 p 215) . Sin 25 embargo, no hay ningún método disponible que permita el cosuministro garantizado de múltiples antígenos y moléculas de ARNi a las mismas APC.

Sumario Según la presente invención, se proporciona una célula de mamífero apoptótica o pre-apoptótica cultivada in vitro, que comprende: 30

(a) una molécula de ARNi capaz de regular negativamente un gen diana; y

(b) un vector de expresión capaz de expresar una proteína pro-apoptótica, para emplear en terapia.

La invención utiliza células apoptóticas (AC) para el suministro a células vivas de ARN cortos capaces de regular negativamente la expresión génica mediante interferencia de ARN (iARN) . La invención aborda el problema de suministrar moléculas de ARNi a células de mamífero in vivo y la capacidad para ligar la presencia de un antígeno o 35 antígenos ya sintetizados con una molécula de ARNi como parte del mismo conjunto para suministrar.

En la presente memoria también se describe un método para generar AC que contengan una molécula de ARNi, que incluye las etapas de (1) proporcionar una molécula de ARNi, tal como ARN de interferencia corto (ARNip) o un vector capaz de expresar un ARN en horquilla corto (ARNhc) , dirigido a un gen diana de interés; (2) introducir la molécula de ARNi en células preapoptóticas (pre-AC) , preferiblemente por transfección; y (3) inducir apoptosis, por 40 ejemplo, por exposición a UV o expresión de una proteína pro-apoptótica como BAX, para crear una AC que contenga la molécula de ARNi.

En un ejemplo la molécula de ARNi contiene una secuencia polinucleotídica sustancialmente complementaria a un ARN mensajero (ARNm) que codifica el gen diana. En un ejemplo preferido la molécula de ARNi comprende un ARN bicatenario (ARNbc) , que contiene una secuencia sentido que corresponde a una secuencia parcial del ARNm de 45 gen diana y una secuencia antisentido que es sustancialmente complementaria y capaz de hibridar específicamente con un ARNm de gen diana.

En una realización, la molécula de ARNi comprende una molécula de ARN bicatenaria (ARNbc) corta de aproximadamente 19-27 pares de bases. En una realización preferida la molécula de ARNi es un ARNip, que comprende una molécula de ARN bicatenario (ARNbc) corta de aproximadamente 19-23 pares de bases, teniendo 50 cada hebra un saliente monocatenario de aproximadamente dos bases en un extremo.

En otra realización, la molécula de ARNi se proporciona por un vector capaz de expresar un ARN en horquilla corto (ARNhc) o un ARN de interferencia corto (ARNip) . En una realización preferida, el vector contiene uno o más de un promotor de ARN polimerasa III que controla la transcripción de la molécula de ARNi.

En una realización, la molécula de ARNi se introduce en la célula de mamífero por transfección, electroporación o microinyección. En otra realización, la molécula de ARNi se introduce en la célula de mamífero por suministro de un plásmido de ADN o vector viral que codifica un ARN en horquilla corto (ARNhc) .

En un ejemplo, el método incluye la etapa adicional de introducir un ADN plasmídico o vector de expresión viral que contiene una secuencia polinucleotídica que codifica una proteína proapoptótica, tal como proteína BAX, en las 5 células de mamífero prepapoptóticas.

En un ejemplo la molécula de ARNi y el vector de expresión que contiene una secuencia polinucleotídica que codifica una proteína proapoptótica se introducen ambos en la célula de mamífero, por ejemplo por co-transfección in vitro o introduciendo la molécula de ARNi y el vector de expresión en un órgano o tejido por electroporación, pistola génica o inyección. 10

En la presente memoria también se describe un método para transfectar una célula de mamífero, que incluye las etapas de: (a) proporcionar una célula de mamífero que expresa un gen diana, siendo capaz la célula de mamífero de fagocitosis; y (b) exponer la célula de mamífero a una célula apoptótica, que contiene una molécula de ARNi capaz de regular negativamente el gen diana, en condiciones por las que la célula apoptótica se capta por la célula de mamífero. La molécula de ARNi regula después negativamente la expresión del gen diana en la célula de 15 mamífero. En ejemplos alternativos, las células de mamífero se exponen a las células apoptóticas in vivo o in vitro. En un ejemplo preferido, la célula de mamífero es una célula presentadora de antígenos.

En la presente memoria también se describe una célula huésped de mamífero, que comprende: (a) una o varias moléculas de ARNi capaces de regular negativamente un gen diana; y (b) un vector de expresión capaz de expresar una proteína proapoptótica. En un ejemplo preferido la célula huésped de mamífero expresa uno o varios antígenos, 20

como autoantígenos o antígenos donadores. Las células huésped de mamífero pueden convertirse a AC para su uso en procedimientos de transfección mediados por células.

Muchas células pueden procesar AC, en particular, células presentadoras de antígenos (APC) como células dendríticas (DC) que dirigen respuestas inmunes. La capacidad para suministrar antígeno y una molécula de ARNi 25

capaz de modificar la función de una APC, como DC, como parte del mismo conjunto permitirá el aumento del control sobre las respuestas inmunes inducidas (es decir, tolerogénicas frente a inmunogénicas) para antígenos presentes en las AC. Este enfoque puede adaptarse para su uso en la prevención de rechazo de trasplante (con antígenos donadores) y tratamiento de enfermedades autoinmunes (con autoantígenos) .

Breve descripción de los dibujos Estas características, aspectos y ventajas de la presente invención se entenderán mejor con respecto a la siguiente descripción, reivindicaciones adjuntas y dibujos adjuntos en los que:

la Figura 1 muestra representaciones esquemáticas de los plásmidos usados para generar células de mamífero que contienen una molécula de ARNi (RUChc y hcII) y/o para generar AC (BAX) , así como plásmidos que contienen 35 genes indicadores (RUC y LUC) usados para controlar la regulación negativa de un gen diana (RUC) de acuerdo con métodos descritos en la presente memoria.

la Figura 2 muestra actividad de luciferasa de Renilla (RUC) de células COS-7 que expresan el ADNc de RUC y co-... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Una célula de mamífero apoptótica o pre-apoptótica cultivada in vitro, que comprende:

(a) una molécula de ARNi capaz de regular negativamente un gen diana; y

(b) un vector de expresión capaz de expresar una proteína pro-apoptótica, 5

para emplear en terapia.

2. La célula de mamífero para usar en terapia según la reivindicación 1, en la que dicha molécula de ARNi es un ARN de interferencia corto (ARNip) o un ARN en horquilla corto (ARNhc) .

3. La célula de mamífero para usar en terapia según la reivindicación 1 o 2, en la que dicha molécula de ARNi comprende un ARN bicatenario (ARNbc) corto de 19-27 pares de bases. 10

4. La célula de mamífero para usar en terapia según la reivindicación 2, en la que dicho ARNip comprende un ARN bicatenario (ARNbc) corto de 19-23 pares de bases, y comprende salientes monocatenarios de dos bases en cada extremo.

5. La célula de mamífero para usar en terapia según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que dicha molécula de ARNi es codificada por un vector capaz de expresar un ARN en horquilla corto (ARNhc) o un ARN de 15 interferencia corto (ARNip) .

6. La célula de mamífero para usar en terapia según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que expresa uno o varios antígenos.

7. La célula de mamífero para usar en terapia según la reivindicación 6, en la que dicho antígeno es un autoantígeno. 20

8. La célula de mamífero de la reivindicación 7, para emplear en el tratamiento de una enfermedad autoinmune.

9. La célula de mamífero para usar en terapia según la reivindicación 6, en la que dicho antígeno es un antígeno donador.

10. La célula de mamífero de la reivindicación 9, para emplear en el tratamiento o prevención de un rechazo a un transplante. 25

11. La célula de mamífero de la reivindicación 1, para emplear en la inducción de inmunotolerancia, en donde dicho gen diana es CD40.


 

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