Método de identificación precoz del sexo en especies del género Scophthalmus.

Método para identificar el sexo en especies del género Scophthalmus antes de que tenga lugar la maduración sexual, que comprende: la extracción de DNA de una muestra biológica aislada de un individuo; poner en contacto la muestra a analizar con una mezcla de reacción, que contiene cebadores capaces de amplificar el marcador microsatélite M-SmaSD; amplificar mediante la reacción en cadena de la polimerasa el marcador microsatélite M-SmaSD; y realizar el genotipado del individuo. Además se refiere a los dos cebadores mencionados utilizados en dicho método, así como a un kit de diagnóstico que comprende los elementos adecuados para llevar a cabo este método

Método de identificación precoz del sexo en especies del género Scophthalmus.

La presente invención se encuentra dentro del campo de la biología molecular y la acuicultura y se refiere a un método para identificar el sexo en especies del género Scophthalmus antes de que tenga lugar la maduración sexual, lo que permite la selección precoz de los individuos de mayor interés productivo, en este caso, las hembras.

Estado de la técnica anterior

El rodaballo (Scophthalmus maximus) posee un alto valor comercial y ha sido cultivado intensivamente durante la última década. Con el fin de conseguir el éxito en la acuicultura a gran escala, es necesaria la mejora genética de esta especie y/o la selección asistida por marcadores genéticos de los individuos más interesantes para los cultivos.

La evaluación de los recursos genéticos en poblaciones naturales constituye una herramienta esencial que se ha venido aplicando en diferentes especies, y en particular en rodaballo (Bouza et al., 2002, Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences 59: 1460-1473), mediante el análisis de las variantes alélicas de diferentes marcadores (isoenzimas, AFLP, RAPD, microsatélites, etc.) o mediante el análisis de secuencias mitocondriales (Moritz, 1994, Trends in Ecology and Evolution 9: 373-375). La estimación de parentescos moleculares tiene gran interés para los programas de selección genética, y para ello se precisa de marcadores genéticos altamente polimórficos, técnicamente fiables y preferentemente codominantes. Los candidatos idóneos son los loci microsatélites que se han usado ampliamente para tal fin (Liu y Cordes, 2004, Aquaculture 238: 1-37), y en particular en rodaballo (Castro et al., 2004, Aquaculture, 242: 119-135). Los marcadores moleculares, además suponen un método para confirmar la herencia exclusiva paterna o materna en individuos androgenéticos y ginogenéticos, respectivamente (Felip et al., 2000, Marine Biotechnology 2: 301-306), metodología que también se ha aplicado a rodaballo (Castro et al., 2003, Marine Biotechnology, 5: 584-592). Estos marcadores moleculares, tienen múltiples aplicaciones en la fundación de stocks de reproductores y en el desarrollo de planes de selección.

Aunque los marcadores genéticos son una herramienta empleada en acuicultura para llevar a cabo la selección asistida por marcadores de individuos de interés productivo dentro de una población en cultivo (Thomas Moen et al., 2008, BMC Genetics. 9:18), nunca habían sido empleados para seleccionar individuos de rodaballo en base a su sexo, porque se desconocían los marcadores asociados a su determinación.

En aquellas especies en cultivo en que las ventajas de crecimiento, maduración o adaptación al mercado estén asociadas a uno de los sexos, el estudio de los mecanismos de determinación sexual es esencial para poder obtener poblaciones monosexo. El conocimiento del sexo a edades tempranas es necesario en el manejo de las poblaciones en cultivo y en el establecimiento de stocks de reproductores. No obstante, la determinación del sexo en peces presenta características peculiares dado que existe una mayor labilidad y versatilidad que en el resto de los vertebrados (Bull, 1983, Benjamin Cumming Pub. Menlo Park, California. EE UU: 316 pp): son poco frecuentes los heteromorfismos cromosómicos asociados al sexo, se han descrito mecanismos poligénicos de determinación sexual, es factible la reversión sexual mediante tratamientos hormonales, es frecuente el hermafroditismo y los factores ambientales pueden influir en la determinación sexual. Sin embargo, hay indicios de mecanismos genéticos de determinación sexual similares a los de los vertebrados (Hunter y Donaldson, 1983, Fish Physiology 9 B: 223-303. Academic Press. Nueva York; Nanda et al., 1992, Chromosoma 101: 301-310).

Como en otras especies de peces teleósteos, en el rodaballo las hembras crecen más rápidamente que los machos alcanzando el tamaño comercial entre tres y seis meses antes que estos. Además, las hembras maduran sexualmente más tarde (a los 24 meses de edad frente a los 15-18 meses de los machos). Dicha maduración está asociada con una pérdida de calidad de la carne, una mayor susceptibilidad a enfermedades y una ralentización del crecimiento. Por todo ello, en el cultivo intensivo de esta especie es de gran interés incrementar la proporción de hembras, ya que presentan un mayor valor económico.

Sin embargo, la determinación del sexo en rodaballo es compleja y no se puede realizar con fiabilidad hasta después de que se produzca la maduración sexual, lo que imposibilita la detección precoz de machos y hembras necesaria para llevar a cabo los planes de selección. El gen o genes responsables de que la gónada esté predeterminada a convertirse en ovario o testículo pueden estar en un solo par cromosómico, en el par sexual, o distribuidos en distintos lugares del genoma.

Con anterioridad, se ha detectado la existencia de un comportamiento cromosómico diferencial durante la meiosis entre machos y hembras triploides, que podría explicar la diferencia en la maduración gonadal entre ambos sexos de rodaballo (Cuñado et al., 2001, Genome 44: 1143-1147; Cuñado et al., 2002, Heredity 89: 460-464). Además se ha visto que los triploides de esta especie tienen la ventaja de evitar los problemas asociados a la maduración gonadal y muestran una proporción superior de hembras (Piferrer et al., 2000, Aquaculture 188: 79-90; Cal et al., 2006, Aquaculture, 251: 99-108), lo cual es interesante en las poblaciones de rodaballo, en las que las hembras crecen más rápidamente que los machos. Sin embargo, la metodología de obtención de triploides aún ha de ser valorada y adaptada para su aplicación a escala industrial.

Algo similar ocurre en el caso de los ginogenéticos (individuos de constitución genética matrilineal). El análisis de la proporción de sexos en ginogenéticos ha aportado información relevante en relación con la elucidación de los mecanismos de determinación sexual en diferentes especies, y en particular en rodaballo (Cal et al, 2006, Journal of Fish Biology, 68: 401-413).

Otra de las aproximaciones a esta cuestión ha sido la búsqueda de secuencias de ADN específicas asociadas al sexo en otras especies de peces (Nakayama et al, 1994, Chromosoma 103: 31-39). Así, en el lenguado japonés se han logrado asociar determinadas regiones genéticas con la determinación del sexo y se ha desarrollado un método basado en la técnica de PCR para amplificar estas regiones de ADN, las cuales posteriormente son analizadas en un gel en el que la diferencia de tamaños de los fragmentos obtenidos permite determinar el sexo del individuo analizado (W02008117715 A1). No obstante, no existe ninguna técnica similar a esta que permita una identificación sexual en Scophthalmus maximus, por no haberse encontrado ninguna región genética asociada con la determinación sexual, de manera que la selección en base al sexo asistida por marcadores se ha podido desarrollar en otras especies de peces pero no así en el rodaballo.

En rodaballo, se han realizado aproximaciones citogenéticas con cromosomas mitóticos (Bouza, Sánchez y Martínez, 1994, Mar. Biol. 120: 609-613) y meióticos (Cuñado, Terrones, Sánchez, Martínez y Santos, 2001, Genome, 44: 1143-1147) para tratar de evidenciar heteromorfismos asociados al sexo, pero sin resultados positivos.

Se han aplicado técnicas de genómica estructural (mapas genéticos y "quantitative trait loci" o QTL) y proteómica para detectar regiones genómicas o genes específicos relacionados con los mecanismos de diferenciación gonadal en esta especie (Martínez, P., 2005, Boletín Instituto Español de Oceanografía. 21 (1-4): 225-238). En relación a ello, se ha construido un mapa genético con microsatélites de Scophthalmus maximus (Bouza, 2007, Genetics 177: 2457-2467), que ha aportado la posibilidad de identificar QTLs relacionados con el crecimiento y la resistencia a enfermedades y con la detección de regiones genómicas asociadas con la determinación sexual, que pueden tener aplicación en la selección asistida por marcadores. No obstante, hasta la fecha no se había conseguido asociar ninguna región genética concreta a la determinación sexual.

Debido a todas estas dificultades, hasta el momento la selección se realiza a una edad en la que... [Seguir leyendo]

1. Método de obtención de datos para la identificación precoz del sexo en especies del género Scophthalmus, que comprende: