MÉTODO AUXILIAR PARA DIAGNOSIS Y TERAPIA DE CÁNCER CON NUCLEOLINA.

Método para determinar la probabilidad de éxito del tratamiento contra el cáncer con endoestatina en un sujeto,

que comprende: a. detectar selectivamente una muestra de dicho sujeto por el nivel de expresión de nucleolina; y b. determinar si dicho sujeto es sensible al tratamiento del cáncer con endoestatina basándose en la cantidad de expresión de nucleolina, en donde una mayor cantidad de nucleolina indica una mayor probabilidad de éxito.

Método auxiliar para diagnosis y terapia de cáncer con nucleolina.

Campo de la invención La presente invención se refiere a un nuevo método para identificar sujetos con cáncer, en particular, pacientes humanos, que son candidatos adecuados para el tratamiento antiangiogénico contra el cáncer. La presente invención también se refiere a una nueva estrategia para buscar y detectar inhibidores de la angiogénesis, moléculas que se cree que son eficaces para reducir el crecimiento maligno de las células, particularmente en las neoplasias malignas que son dependientes de la angiogénesis. La presente invención describe métodos para detectar selectivamente inhibidores de la angiogénesis utilizando la molécula nucleolina (NL) . En particular, la presente invención se refiere a la detección selectiva de inhibidores de la angiogénesis que funcionan de un modo que es análogo al de la proteína endoestatina (ES) . La invención se basa en el descubrimiento de que la nucleolina es un receptor específico de la endoestatina y de que está implicado en la vía de la transducción de señales relacionada con la inhibición de la angiogénesis debida a la endoestatina.

Descripción de la técnica relacionada Recientemente se ha desarrollado un nuevo método para tratar el cáncer en el cual se inhibe la angiogénesis cancerosa mediante la endoestatina, se bloquea el riego sanguíneo del tumor y, por lo tanto, se reprime el crecimiento del mismo. La endoestatina (citada en la presente memoria como «ES») es un dominio globular de 20 kDa del extremo carboxilo del colágeno XVIII, una proteína de tipo colágeno. Originalmente se aisló del sobrenadante de una línea celular cultivada de hemangioendotelioma murino por su capacidad para inhibir la proliferación de las células endoteliales capilares. En los ensayos con animales se indujo la dormencia del tumor después de varios ciclos de tratamiento con ES sin ninguna resistencia a los fármacos. Además, se observó que la toxicidad de la ES era baja en las pruebas con animales y en los ensayos clínicos. La ES muestra una actividad potente a la hora de inhibir la proliferación, migración, adhesión y supervivencia de las células endoteliales, y a la hora de inducir la apoptosis celular. Aunque se sospecha que las integrinas, tropomiosina, glipicanos y selectina E son receptores de la ES asociados a la migración celular, y que la β-catenina y el adaptador Shb están implicados en la parada en G1 y en la apoptosis de las células endoteliales inducidas por la ES, todavía se debate el mecanismo molecular exacto de la ES, y sigue sin conocerse la razón de la poca toxicidad de la ES en las pruebas con animales y en los ensayos clínicos. Además, todavía falta una explicación adecuada del hecho de que se requiera una concentración elevada de ES para conseguir el efecto antitumoral en las pruebas con animales y en los ensayos clínicos.

En el contexto del tratamiento del cáncer con endoestatina, se ha alabado que la ES sea un tratamiento eficaz contra el cáncer porque se dedica a acabar con las células cancerosas mediante la inhibición de la angiogénesis, un proceso que las células cancerosas requieren para formar metástasis. Cada aumento en la población de células tumorales debe ir precedido de un aumento de nuevos capilares que convergen en el tumor. Este fenómeno es casi universal; la mayoría de los tumores sólidos humanos y de las neoplasias malignas hematopoyéticas dependen de la angiogénesis. Otras ventajas del tratamiento antiangiogénico incluyen la poca toxicidad, la resistencia farmacológica mínima y que la repetición de los ciclos de tratamiento antiangiogénico pueden ir seguidos por una dormencia prolongada del tumor sin más tratamiento. Véase Boehm et al., «Antiangiogenic therapy of experimental cancer does not induce acquired drug resistance». Nature (1997) 390: 404-407. Sin embargo, hasta la fecha todavía no está claro el modo de acción por el que actúa la ES. Por consiguiente, el tratamiento con la ES se está aplicando a los pacientes con cáncer indiscriminadamente, sin hacer referencia a la sensibilidad del paciente al tratamiento. Además, los investigadores encontraron que para conseguir el efecto esperado contra el cáncer mediante la función inhibidora de la angiogénesis que tiene la ES, se tiene que inyectar una gran cantidad de ES en los mamíferos portadores de cáncer, en particular en los seres humanos. Como se necesita una gran cantidad de ES, el precio alcanza un valor inaccesiblemente caro. Por consiguiente, hay una necesidad urgente de descubrir nuevos inhibidores de la neoangiogénesis económicos y eficaces para su uso en el tratamiento contra el cáncer. Se han llevado a cabo numerosos ensayos clínicos con la esperanza de encontrar un fármaco antiangiogénico eficaz. Sería un progreso significativo si los pacientes se pueden seleccionar utilizando criterios objetivos de modo que se puedan tratar con más eficacia con la ES.

La eficacia del tratamiento del cáncer puede variar enormemente entre los pacientes tratados dependiendo de muchos factores, tanto externos como internos. Los factores externos incluyen las diferentes etapas del cáncer en el momento del tratamiento, donde la detección temprana es clave para un tratamiento y recuperación eficaces, la fuerza relevante del tratamiento del cáncer, como cirugía, quimioterapia o radioterapia. Los factores internos incluyen la salud del sistema inmunitario del paciente, en el cual un sistema fuerte puede sostener una posología de tratamiento más larga y potente y, por lo tanto, ayuda a que el paciente se recupere más rápido. Una cuestión clave que se está comenzando a explorar en el tratamiento del cáncer, y en la medicina en general, es lo que se denomina medicina personalizada. La noción de que diferentes individuos pueden tener diferentes tolerancia y sensibilidad al mismo fármaco o tratamiento contra el cáncer ha inspirado una gran parte de las estrategias en un intento por aumentar la eficacia de un tratamiento contra un cáncer en particular. Por lo tanto, debido a variaciones individuales, un fármaco que es eficaz en un paciente puede no serlo en otro. En el terreno del tratamiento del cáncer, se ha intentado utilizar un perfil génico para entender si un fármaco determinado puede ejercer su función terapéutica con eficacia en un paciente con un perfil genético particular. Para entender la aplicación individualizada del tratamiento con ES, recientemente se han intentado utilizar las micromatrices de genes para estudiar el perfil de expresión génica que subyace a los efectos inhibidores de la ES sobre la angiogénesis de las células endoteliales. Véase M. Mazzanti et al., Genome Research, 14: 1585-1593 (2004) .

La NL es una proteína no histónica ubicua que se aisló por primera vez del nucléolo. Resulta muy interesante que la cantidad de NL esté correlacionada con la proliferación celular, que está regulada por la granzima A y la actividad de auto-escisión. La nucleolina también sufre la autoescisión, que disminuye cuando las células entran en una etapa proliferativa así como cuando se escinde por la granzima A, una esterasa secretada por los linfocitos citotóxicos (Chen et al., J. Biol. Chem., 1991, 266, 7754-7758; Fang y Yeh, Exp. Cell. Res., 1993, 208, 48-53; Pasternack et al., J. Biol. Chem., 1991, 266, 14703-14708) . La escisión y la degradación concomitante de la proteína proporciona la regulación postraduccional de la nucleolina.

Como proteína multifuncional, la NL ejerce un efecto crítico y fundamental sobre la proliferación celular, que incluye la organización de la cromatina nucleolar, el empaquetamiento del ARN precursor, la transcripción del ADNr y el ensamblaje del ribosoma. Estas actividades están reguladas por determinadas proteína cinasas, tales como la caseína cinasa 2 (CK2) y la cdc2, que están bajo el control estricto de otras proteínas del ciclo celular. Además, la NL también funciona como un receptor de la superficie celular, transbordando entre la superficie celular, el citoplasma y el núcleo. Como receptor de muchos virus y citocinas, la NL desencadena la interiorización de los ligandos tan pronto como estos ligandos se unen a ella.

La nucleolina ha sido descrita por Orrik et al (1973) como una proteína con una masa molecular de unos 100 a 110 kDa y existe principalmente en el núcleo de las células en propagación. La nucleolina es capaz de autodegradarse y proporcionar dos bandas de degradación de unos 70 y 50 kDa en el análisis de inmunotransferencia. La nucleolina está muy fosforilada y metilada, y puede estar ADP-ribosilada. Como la síntesis de la nucleolina está correlacionada positivamente con un aumento... [Seguir leyendo]

1. Método para determinar la probabilidad de éxito del tratamiento contra el cáncer con endoestatina en un sujeto, que comprende:

a. detectar selectivamente una muestra de dicho sujeto por el nivel de expresión de nucleolina; y

b. determinar si dicho sujeto es sensible al tratamiento del cáncer con endoestatina basándose en la cantidad de expresión de nucleolina, en donde una mayor cantidad de nucleolina indica una mayor probabilidad de éxito.

2. Método para detectar selectivamente un inhibidor de la angiogénesis específico de la nucleolina eficaz a la hora de inhibir la angiogénesis, que comprende:

a. aplicar un ensayo de fijación apropiado a un conjunto de moléculas candidatas, para obtener de ese modo numerosas moléculas específicas de la nucleolina;

b. analizar cada una de las muchas moléculas específicas de la nucleolina por su eficacia a la hora de inhibir la angiogénesis mediante un ensayo de antiangiogénesis; y

c. seleccionar la molécula específica de la nucleolina resultante que es eficaz a la hora de inhibir la angiogénesis como queda demostrado mediante el ensayo de antiangiogénesis.

3. Método según la reivindicación 2, en el que el inhibidor de la angiogénesis específico de la nucleolina es una proteína o un péptido.

4. Método según la reivindicación 2, en el que el inhibidor de la angiogénesis específico de la nucleolina es una molécula pequeña.

5. Método según la reivindicación 2, en el que el inhibidor de la angiogénesis específico de la nucleolina se utiliza para curar una enfermedad dependiente de la angiogénesis.

6. Método según la reivindicación 5, en el que la enfermedad dependiente de la angiogénesis es cáncer.

7. Método según la reivindicación 5, en el que la enfermedad dependiente de la angiogénesis es una enfermedad de las células endoteliales.

8. Método para seleccionar un inhibidor de la angiogénesis que tiene la capacidad de inhibir la proliferación y/o migración endotelial cuando se añade a las células endoteliales en proliferación in vitro, que comprende las etapas de:

a. utilizar un método farmacéuticamente aceptable para descubrir las moléculas que interaccionan específicamente con la nucleolina como molécula diana;

b. analizar las moléculas así obtenidas de la etapa (a) por su eficacia para inhibir la proliferación y/o migración de las células endoteliales; y

c. determinar la molécula que inhibe con eficacia la proliferación y/o migración de las células endoteliales, en donde la eficacia de la función antiangiogénica de dicha molécula se compara con la de la endoestatina.

9. Método según la reivindicación 8, en el que la molécula específica de la nucleolina es una proteína o un polipéptido.

10. Método según la reivindicación 8, en el que la molécula específica de la nucleolina es una molécula pequeña.

11. Método para aumentar la receptividad de una célula diana a un inhibidor de la angiogénesis, que comprende:

a. introducir una nucleolina exógena en las células diana in vitro, para obtener de esta manera numerosas células diana modificadas que expresan la nucleolina exógena; y

b. medir la tasa de destrucción de las células diana modificadas debida a la endoestatina in vitro, en donde un aumento de la tasa de destrucción es indicativa de un aumento de la receptividad de la célula diana.

12. Método según la reivindicación 11, en el que la célula diana es una célula cancerosa.

13. Método según la reivindicación 11, en el que la célula diana es una célula endotelial.

14. Método según la reivindicación 11, en el que dicho inhibidor de la angiogénesis es la endoestatina.

15. Método según la reivindicación 11, en el que la nucleolina exógena se introduce en la célula diana mediante un vector vírico.

16. Método para potenciar el efecto antiangiogénico de un inhibidor de la angiogénesis en una célula endotelial diana, que comprende:

a. introducir en dicha célula diana una cantidad farmacéuticamente eficaz de la molécula de nucleolina exógena in vitro, siendo capaz dicha molécula de nucleolina de expresarse en dicha célula diana; y b. incubar dicha célula diana con dicho inhibidor de la angiogénesis in vitro, para provocar de este modo la inhibición del crecimiento de dicha célula diana.

17. Método según la reivindicación 16, en el que dicho inhibidor de la angiogénesis es la endoestatina.

18. Método según la reivindicación 16, en el que dicha célula endotelial diana es una célula endotelial en un tejido canceroso.

19. Método para determinar la sensibilidad de un paciente al tratamiento con endoestatina, que comprende poner en contacto una muestra de un paciente con un anticuerpo contra la nucleolina, y detectar la formación de un complejo entre el anticuerpo y la nucleolina, en donde una concentración más alta de la presencia del complejo indica una mayor probabilidad de éxito del tratamiento con endoestatina.

20. Método para identificar células cancerosas diana que son sensibles a un tratamiento con el inhibidor de la 15 angiogénesis, que comprende:

a. generar un anticuerpo antinucleolina;

b. poner en contacto una muestra de un sujeto con dicho anticuerpo antinucleolina; y

c. identificar las células cancerosas diana que son sensibles al tratamiento con el inhibidor de la angiogénesis como

indica el nivel de nucleolina presente en la muestra, en donde una concentración más alta indica una mayor 20 sensibilidad.

21. Método según la reivindicación 20, en el que el anticuerpo antinucleolina es un anticuerpo policlonal.

22. Método según la reivindicación 20, en el que el anticuerpo antinucleolina es un anticuerpo monoclonal.

23. Método según la reivindicación 20, en el que el inhibidor de la angiogénesis es la endoestatina.