UN PROCEDIMIENTO PARA MEJORAR LA EFICACIA DE LAS PROTEÍNAS MODIFICADORAS DE LA RESPUESTA BIOLÓGICA Y MUTEÍNAS ILUSTRATIVAS.

Variante de citoquina de haz de 4 hélices α, caracterizada por la sustitución de fenilalanina por valina en el dominio de unión de la citoquina

La presente invención se refiere a una variante de proteína en la que la fenilalanina se sustituye por valina en un dominio de unión que tiene una función modificadora de la respuesta biológica por unión a un receptor, ligando o sustrato. Más en particular, la presente invención se refiere a una variante de proteína que sustituye el resto de fenilalanina por valina en un dominio de hélice  que participa en la unión de una proteína citoquina humana a un receptor correspondiente.

Técnica anterior

Muchas enfermedades humanas están causadas por la pérdida de la función de proteínas debido a defectos o una cantidad insuficiente de una proteína. Para tratar dichas enfermedades, se han administrado proteínas relacionadas directamente a los pacientes. Sin embargo, muchas proteínas fisiológicamente activas usadas como medicamentos se degradan fácilmente en el suero antes de que lleguen a los tejidos diana y actúen en los mismos. Por esta razón, la mayoría de las proteínas fisiológicamente activas que tienen valor terapéutico se administran en exceso o frecuentemente a los pacientes para mantener una concentración adecuada capaz de ofrecer efectos terapéuticos satisfactorios.

Un procedimiento para resolver los problemas anteriores es conjugar proteínas fisiológicamente activas con polietilenglicol (PEGilación) o microencapsularlas. Sin embargo, estos procedimientos son difíciles porque las proteínas diana se producen principalmente en microorganismos y se purifican, y después son PEGiladas o microencapsuladas. Además, se puede producir entrecruzamiento en posiciones no deseadas, que pueden afectar negativamente a la homogeneidad de los productos finales.

Otro procedimiento implica la glicosilación. Las proteínas de superficie celular y proteínas secretoras producidas por células eucariotas son modificadas por un proceso de glicosilación. Se sabe que la glicosilación influye en la estabilidad in vivo y función de proteínas, así como en sus propiedades fisiológicas. Sin embargo, puesto que las proteínas glicosiladas sólo pueden ser producidas por células eucariotas capaces de realizar la glicosilación, su procedimiento de producción es complicado, y es difícil conseguir productos finales homogéneos que sean glicosilados en todas las posiciones deseadas.

Además, todas las técnicas convencionales mejoran los problemas asociados con la frecuencia de administración, pero no aumentan la eficacia fisiológica de las proteínas, conduciendo a una dosificación excesiva. Por ejemplo, NESP desarrollado por la Amgen Company (véase la patente de EE.UU. nº 6.586.398) mejora la frecuencia de administración prolongando las semividas de las proteínas en la sangre, pero no aumenta la eficacia de las proteínas, conduciendo a una dosificación excesiva que puede inducir la producción de anticuerpos bloqueantes.

Un procedimiento usado para mejorar la eficacia de las proteínas fisiológicamente activas es mutagenizar algunos restos de aminoácidos de una proteína natural para mejorar la actividad biológica de la proteína. Se describen variantes de proteínas relacionadas en las siguientes publicaciones de patentes: (1) patente de EE.UU. nº 5.457.

089: variantes de la eritropoyetina humana (EPO) en las que la región carboxilo terminal se alteró para aumentar la afinidad de unión de la EPO a su receptor, (2) publicación de patente internacional nº 02/077034: variantes del factor estimulador de colonias de granulocitos humano (G-CSF) en las que se alteró un epítopo de linfocito T para reducir la inmunogenicidad del G-CSF humano en seres humanos; (3) publicación de patente internacional nº 99/57147: variantes de trombopoyetina humana (TPO) preparadas sustituyendo el ácido glutamínico en la posición 115 por lisina, arginina o tirosina en una proteína TPO que tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a los restos de aminoácidos 7º al 151º de la TPO madura humana; y (4) patentes de EE.UU. nº 6.136.563 y 6.022.711 que describen variantes de la hormona del crecimiento humana que tienen sustituciones de alanina en las posiciones 18, 22, 25, 26, 29, 65, 168 y 174.

Sin embargo, las variantes de proteínas mencionadas antes son formas alteradas hechas para mejorar sólo la eficacia terapéutica independientemente de cambios en la antigenicidad in vivo. Por lo tanto, la escala, grado y posición de estas alteraciones tienen un alto potencial para inducir respuestas inmunitarias en seres humanos. La antigenicidad en seres humanos puede causar efectos adversos graves (Casadevall y col. N. Eng. J. Med. 2002, vol. 346, p. 469).

**(Ver fórmula)**

Descripción de la invención

Por lo tanto, un objeto de la presente invención es proporcionar variantes de proteínas modificadoras de la respuesta biológica que tengan mejor acción farmacológica, que sean capaces de maximizar los efectos modificadores de la respuesta biológica tras la administración y prevenir la formación de anticuerpos bloqueantes mediante una mejora en la eficacia de las proteínas modificadoras de la respuesta biológica convencionales, y procedimientos para preparar dichas variantes.

En un aspecto, la presente invención proporciona una variante de proteína de acuerdo con la reivindicación 1, de una proteína que tiene una función modificadora de la respuesta biológica por unión a un receptor, ligando o sustrato.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un ADN de acuerdo con la reivindicación 6.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un vector de expresión recombinante de acuerdo con la reivindicación 7.

En otro aspecto más, la presente invención proporciona una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 9.

En otro aspecto más, la presente invención proporciona un procedimiento para preparar una variante de proteína, que comprende cultivar una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 9 y aislar la variante de proteína de un cultivo resultante.

En otro aspecto más, la presente invención proporciona una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 11.

Breve descripción de los dibujos

Los objetos, características y otras ventajas anteriores y otros de la presente invención, se entenderán más claramente a partir de la siguiente descripción detallada tomada en conjunto con los dibujos que acompañan, en los que:

La figura 1A es un alineamiento múltiple de secuencias de aminoácidos de dominios que participan en la unión de citoquinas de haces de 4 hélices a los correspondientes receptores;

La figura 1B es un alineamiento múltiple de secuencias de aminoácidos de dominios que participan en la unión de interferones a los correspondientes receptores;

La figura 2A muestra los resultados de la transferencia Western de variantes de TPO de acuerdo con la presente invención (desde la banda más a la izquierda: marcador, TPO natural; TPO-[F46V]; TPO-[F128V]; TPO-[F131V]; y TPO-[F141V]);

La figura 2B muestra los resultados de la transferencia Western de variantes de EPO de acuerdo con la presente invención (desde la banda más a la izquierda: marcador, EPO natural; EPO-[F48V]; EPO-[F138V]; EPO-[F142V]; y EPO-[F148V]);

La figura 2C muestra los resultados de la transferencia Western de variantes de G-CSF de acuerdo con la presente invención (desde la banda más a la izquierda: marcador, G-CSF natural; G-CSF-[F13V]; G-CSF-[F83V]; G-CSF[F113V]; G-CSF-[F140V]; G-CSF-[F144V]; y G-CSF-[F160V]);

La figura 3A es una gráfica que muestra los niveles de expresión relativos de variantes de TPO de acuerdo con la presente invención, comparados con una TPO natural;

La figura 3B es una gráfica que muestra los niveles de expresión relativos de variantes de EPO de acuerdo con la presente invención, comparados con una EPO natural;

La figura 3C es una gráfica que muestra los niveles de expresión relativos de variantes de G-CSF de acuerdo con la presente invención, comparados con un G-CSF natural;

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La figura 4A muestra los resultados de un ensayo ELISA de la afinidad de unión de variantes de TPO de acuerdo con la presente invención a receptores de TPO;

La figura 4B muestra los resultados de un ensayo ELISA de la afinidad de unión de variantes de EPO de acuerdo con la presente invención a receptores de EPO;

La figura... [Seguir leyendo]

1. Variante de citoquina de haz de 4 hélices , caracterizada por la sustitución de fenilalanina por valina en el dominio de unión de la citoquina.

2. La variante de proteína de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la citoquina de haz de 4 hélices  se selecciona del grupo que consiste en CNTF, EPO, Flt3L, G-CSF, GM-CSF, GH, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL12p35, LPT, LIF, M-CSF, OSM, PL, SCF, TPO, IFN-2A, IFN-2B, IFN-, IFN-, IFN- e IFN-.

3. La variante de proteína de acuerdo con la reivindicación 2, en la que el CNTF, EPO, G-CSF, GM-CSF, GH, IL-4, IL-6, IL-12p35, LIF, OSM, PL y TPO se alteran sustituyendo un resto de fenilalanina por valina de los restos de aminoácidos entre las posiciones 110 y 180.

4. La variante de proteína de acuerdo con la reivindicación 2, en la que el IFN-2A, IFN-2B, IFN-, IFN, IFN- e IFN- se alteran sustituyendo un resto de fenilalanina por valina de los restos de aminoácidos entre las posiciones 1 y 50.

5. La variante de proteína de acuerdo con la reivindicación 2, en la que

- el CNTF se altera sustituyendo el resto de fenilalanina por valina en una posición 119, 152 o 178 de una secuencia de aminoácidos designada SEQ ID NO: 1;

- la EPO se altera sustituyendo el resto de fenilalanina por valina en una posición 138, 142 o 148 de una secuencia de aminoácidos designada SEQ ID NO: 2;

- el Flt3L se altera sustituyendo el resto de fenilalanina por valina en una posición 124 de una secuencia de aminoácidos designada SEQ ID NO: 3;

- el G-CSF se altera sustituyendo el resto de fenilalanina por valina en una posición 113, 140, 144 o 160 de una secuencia de aminoácidos designada SEQ ID NO: 4;

- el GM-CSF se altera sustituyendo el resto de fenilalanina por valina en una posición 113 o 119 de una secuencia de aminoácidos designada SEQ ID NO: 5;

- la GH se altera sustituyendo el resto de fenilalanina por valina en una posición 139, 146, 166 o 176 de una secuencia de aminoácidos designada SEQ ID NO: 6;

- la IL-2 se altera sustituyendo el resto de fenilalanina por valina en una posición 42 o 44 de una secuencia de aminoácidos designada SEQ ID NO.:13;

- la IL-3 se altera sustituyendo el resto de fenilalanina por valina en una posición 107 o 113 de una secuencia de aminoácidos designada SEQ ID NO: 14;

- la IL-4 se altera sustituyendo el resto de fenilalanina por valina en una posición 112 de una secuencia de aminoácidos designada SEQ ID NO: 15;

- la IL-5 se altera sustituyendo el resto de fenilalanina por valina en una posición 69 de una secuencia de aminoácidos designada SEQ ID NO: 16;

- la IL-6 se altera sustituyendo el resto de fenilalanina por valina en una posición 124, de una secuencia de aminoácidos designada SEQ ID NO.:17;

- la IL-12p35 se altera sustituyendo el resto de fenilalanina por valina en una posición 180 de una secuencia de aminoácidos designada SEQ ID NO: 18;

- la LPT se altera sustituyendo el resto de fenilalanina por valina en una posición 92 de una secuencia de aminoácidos designada SEQ ID NO: 19;

- el LIF se altera sustituyendo el resto de fenilalanina por valina en una posición 156 de una secuencia de

aminoácidos designada SEQ ID NO: 20;

- el M-CSF se altera sustituyendo el resto de fenilalanina por valina en una posición 311 de una secuencia de aminoácidos designada SEQ ID NO: 21;

- la OSM se altera sustituyendo el resto de fenilalanina por valina en una posición 160 o 169 de una secuencia de aminoácidos designada SEQ ID NO: 22;

- la PL se altera sustituyendo el resto de fenilalanina por valina en una posición 166 o 176 de una secuencia de aminoácidos designada SEQ ID NO: 23;

- el SCF se altera sustituyendo el resto de fenilalanina por valina en una posición 199, 205 o 207 de una secuencia de aminoácidos designada SEQ ID NO: 24;

- la TPO se altera sustituyendo el resto de fenilalanina por valina en una posición 131 o 141 de una secuencia de aminoácidos designada SEQ ID NO: 25;

**(Ver fórmula)**

- el IFN-2A se altera sustituyendo el resto de fenilalanina por valina en una posición 27, 36 o 38 de una secuencia de aminoácidos designada SEQ ID NO: 7;

- el IFN-2B se altera sustituyendo el resto de fenilalanina por valina en una posición 27, 36 o 38 de una secuencia de aminoácidos designada SEQ ID NO: 8;

- el IFN- se altera sustituyendo el resto de fenilalanina por valina en una posición 38 de una secuencia de aminoácidos designada SEQ ID NO: 9;

- el IFN- se altera sustituyendo el resto de fenilalanina por valina en una posición 32 de una secuencia de aminoácidos designada SEQ ID NO: 10;

- el IFN- se altera sustituyendo el resto de fenilalanina por valina en una posición 27, 36 o 38 de una secuencia de aminoácidos designada SEQ ID NO: 11;

- el IFN- se altera sustituyendo el resto de fenilalanina por valina en una posición 39 de una secuencia de aminoácidos designada SEQ ID NO: 12.

6. Un ADN que codifica la variante de proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a

5.

7. Un vector de expresión recombinante al que está operativamente unido el ADN de acuerdo con la reivindicación 6.

8. El vector de expresión recombinante de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el vector de expresión recombinante tiene un número de acceso KCCM-10500, KCCM-10501 o KCCM-10571.

9. Una célula huésped transformada o transfectada con el vector de expresión recombinante de acuerdo con la reivindicación 7 u 8.

10. Un procedimiento para preparar una variante de proteína, que comprende cultivar la célula huésped de acuerdo con la reivindicación 9 y aislar la variante de proteína de un cultivo resultante.

11. Una composición farmacéutica que comprende la variante de proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.