INMUNOLIPOSOMAS DIRIGIDOS MEDIANTE UN FRAGMENTO DE ANTICUERPO PARA LA ADMINISTRACIÓN SISTÉMICA DE GENES.

Inmunoliposomas dirigidos mediante un fragmento de anticuerpo para la administración sistémica de genes. Antecedentes de la invención ES 2 366 100 T3 La presente invención proporciona un constructo para la expresión génica aumentada en células de mamíferos y liposomas (es decir, inmunoliposomas) que comprenden el constructo, que incluyen liposomas dirigidos mediante un fragmento de anticuerpo etiquetados con lípido, y procedimientos para la transfección in vitro utilizando los inmunoliposomas. Se dan a conocer asimismo procedimientos para la administración génica sistémica in vivo. Los liposomas de la presente invención son de utilidad para la administración dirigida de genes y la expresión génica eficaz después de la administración sistémica. La especificidad de los sistemas de administración es consecuencia de los fragmentos de anticuerpo de direccionamiento. Un agente terapéutico anticanceroso ideal contra el cáncer sería uno que se dirigiese selectivamente a una senda celular responsable del fenotipo tumoral y que no fuese tóxico para las células normales. Aunque los tratamientos antitumorales que implican terapia génica son sustancialmente prometedores, se han de resolver múltiples problemas antes de que su potencial se pueda realizar. Quizás el primero de entre los temas asociados a los tratamientos con macromoléculas es el de la administración eficaz de las moléculas terapéuticas a los lugares del organismo en los que se necesitan. Se ha probado una multiplicidad de sistemas de administración (vectores) que incluyen virus y liposomas. El vehículo ideal sería uno que se pudiese administrar sistémicamente (a diferencia de localmente) y que se dirigiese a continuación selectivamente a las células tumorales en sus ubicaciones en el organismo. La efectividad que hace atractivos a los virus como vectores de administración es también su principal inconveniente. En consecuencia, se ha prestado mucha atención a los vectores no víricos para la administración de terapias moleculares. La estrategia mediante liposomas ofrece múltiples ventajas sobre los procedimientos víricos para la administración de genes. Lo más significativo, ya que los liposomas no son agentes infecciosos capaces de autorreplicación, es que no presentan riesgo de transmisión a otros individuos. El ataque a las células tumorales mediante liposomas se puede alcanzar modificando los liposomas de modo que administren su contenido selectivamente a las células tumorales. En la actualidad existe una base de conocimientos significativa sobre las moléculas específicas que residen en la superficie exterior de ciertas células cancerosas. Tales moléculas de la superficie celular se pueden utilizar como dianas para dirigir liposomas a las células tumorales, debido a que las moléculas que residen en el exterior de las células tumorales difieren de las de las células normales. Las publicaciones y otros materiales utilizados en la presente memoria sirven para ilustrar la presente invención o para proporcionar detalles adicionales relativos a la práctica de la presente invención. Las estrategias de terapia génica somática utilizan sistemas de vectores víricos o no víricos. Muchos vectores víricos permiten una elevada eficacia de transferencia génica pero son deficientes en ciertos aspectos [Ledley F.D., et al., Hum. Gene. Ther. 6:1129-1144 (1995)]. Los vectores de transferencia génica no víricos evitan algunos de los problemas asociados con la utilización de vectores víricos. Se ha progresado hacia el desarrollo de formulaciones farmacéuticas no víricas de genes destinadas a la terapia humana in vivo, en particular los sistemas de transferencia génica mediante liposomas catiónicos [Massing U, et al., Int. J. Clin. Pharmacol. Ther. 35:87-90 (1997)]. Las características de los liposomas catiónicos que los hacen versátiles y atractivos para la administración de ADN incluyen: simplicidad de preparación; capacidad para acomplejar grandes cantidades de ADN; versatilidad de utilización con cualquier tipo y tamaño de ADN o ARN; capacidad para transfectar múltiples tipos de células, que incluyen las células que no se dividen; y la falta de inmunogenicidad o biopeligrosidad [Felgner P.L., et al., Ann.NY Acad. Sci., 772:126-139 (1995); Lewis J.G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:3176-3181 (1996)]. Más importante desde la perspectiva de la terapia antineoplásica humana, los liposomas catiónicos han demostrado ser seguros y eficaces para la administración de genes in vivo (Aoki K., et al., Cancer Res., 55:3810-3816 (1997); Thierry A.R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:9742-9746 (1997)]. En la actualidad se están llevando a cabo más de treinta ensayos clínicos utilizando liposomas catiónicos destinados a la terapia génica [Zhang W., et al., Adv. Pharmacology 32:289­ 333 (1997); RAC Comittee Report: Human Gene Therapy Protocols-Diciembre 1998] y ya se encuentran en el mercado liposomas para la administración de pequeñas moléculas terapéuticas (p.ej. agentes antifúngicos y terapéuticos convencionales) [Allen T.M. et al., Drugs, 54 suple.4:8-14 (1997)]. La eficacia de transfección de los liposomas catiónicos se puede incrementar dramáticamente cuando son portadores de un ligando que es reconocido por un receptor de la superficie celular. La endocitosis mediada por receptores consiste en una senda de internalización muy eficaz presente en la superficie de las células eucarióticas [Cristiano R.J. et al., Cancer Gene Ther., 3:49-57 (1996); Cheng P.W., Hum. Gene Ther., 7:275-282 (1996)]. La presencia de un ligando en un liposoma facilita la entrada del ADN en las células mediante primero la unión del ligando a su receptor, en la superficie celular, seguido de la internalización del complejo unido. Se ha examinado la capacidad de múltiples ligandos, que incluyen la transferrina y el folato con el fin de determinar su capacidad de dirigir liposomas, [Lee R.J. et al., J. Biol. Chem., 271:8481-8487 (1996)]. Los niveles de los receptores de transferrina (TfR) son elevados en múltiples tipos de células cancerosas que incluyen las de cáncer de próstata, 2 ES 2 366 100 T3 incluso en las líneas celulares de próstata derivadas de metástasis de ganglio linfático y médula ósea [Keer H.N., et al., J. Urol. 143:381-385 (1990); Chakal-Roy M., et al., J. Clin. Invest. 84:43-50 (1989); Rossi M.C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6197-6201 (1992); Grayhack J.T., et al., J. Urol. 121:295-299 (1979)]. Los niveles elevados de TfR se correlacionan también con la capacidad proliferativa o agresiva de las células tumorales [Elliot R.L., et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 698:159-166 (1993)]. Por consiguiente, los niveles de TfR se consideran de utilidad como marcadores prognósticos y el TfR es una diana potencial para la administración de fármacos en la terapia de las células malignas [Miyamoto T., et al., Int. J. Oral Maxillofac. Surg., 23:430-433 (1994); Thorstensen K., et al., Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl., 215:113-120 (1993)]. En nuestro laboratorio, se han preparado liposomas catiónicos acomplejados con transferrina con una eficacia de transfección en SCCHN de las células tumorales comprendida entre el 60 y el 70%, en comparación con solamente entre un 5 y 20% mediante liposomas catiónicos sin ligando [Xu, L., et al., Hum. Gene Ther., 8:467-475 (1997)]. Además de la utilización de ligandos que son reconocidos por los receptores de las células tumorales, se puede unir anticuerpos específicos a la superficie de los liposomas [Allen, T.M. et al., Stealth Liposomes, págs. 233-244 (1995)] lo que permite dirigirlos a antígenos tumorales de superficie (incluidos, pero sin ser limitante, los receptores) [Allen, T.M., Biochem. Biophys. Acta, 1237:99-108 (1995)]. Dichos inmunoliposomas, especialmente los inmunoliposomas estabilizados estéricamente, pueden administrar fármacos terapéuticos a poblaciones celulares diana específicas [Allen, T.M. et al., Stealth Liposomes, págs. 233-244 (1995)]. Park, et al., [Park, J.W., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:1327-1331 (1995)] descubrieron que los fragmentos Fab del anticuerpo monoclonal (Mab) anti-HER-2 conjugados a liposomas se podían unir específicamente a las células de la línea tumoral de mama SK-BR-3 que sobreexpresan HER-2. Se descubrió que los inmunoliposomas se internalizaban eficazmente mediante endocitosis mediada por receptores a través de la senda de los pozos recubiertos y también posiblemente mediante la fusión de membranas. Además, el anclaje de los fragmentos Fab anti-HER-2 amplifica su efecto inhibidor. Los inmunoliposomas anti-HER-2 cargados con doxorrubiicina también mostraron un efecto citotóxico significativo y específico contra las células diana in vitro e in vivo [Park, J.W., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:1327-1331 (1995)]. Además, Suzuki et al., [Suzuki, S., et al., Br. J. Cancer,... [Seguir leyendo]

1. Constructo para la expresión génica aumentada en células de mamíferos, que comprende, de 5 a 3 (a) las secuencias aumentadoras del adenovirus 5 (Ad5) humano presentes en las unidades cartográficas 0 a 1 del Ad5; (b) un promotor de citomegalovirus (CMV); (c) un sitio de clonación múltiple para la inserción del gen que se debe expresar; y (d) una secuencia poli A de SV40; en el que el extremo 3 del constructo está truncado de manera que, comparado con una secuencia genómica adenoviral de plásmido de citomegalovirus de tipo silvestre, las unidades cartográficas adenovirales 9 a 16 están eliminadas. 2. Constructo según la reivindicación 1, en el que dichas células de mamífero son células humanas. 3. Constructo según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho gen codifica un p53 de tipo silvestre. 4. Complejo de liposoma que comprende (i) un liposoma catiónico, (ii) un ligando dirigido a las células, y (iii) el constructo según la reivindicación 1. 5. Complejo de liposoma según la reivindicación 4, en el que el ligando dirigido a las células es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo. 6. Complejo de liposoma según la reivindicación 5, en el que el fragmento de anticuerpo es una cadena única. 7. Complejo de liposoma según la reivindicación 5, en el que dichos anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprenden una etiqueta lipídica o molécula de cisteína terminal. 8. Complejo de liposoma según la reivindicación 5, en el que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une a un receptor de la transferrina. 9. Procedimiento de expresión de un gen en una célula de mamífero in vitro que comprende poner en contacto el complejo de liposoma según la reivindicación 4 con una célula de mamífero. 10. Procedimiento según la reivindicación 9, en el que la célula de mamífero es una célula humana. 11. Complejo de liposoma según la reivindicación 4, para su utilización como un medicamento. 12. Utilización de un complejo de liposoma según la reivindicación 4 para la preparación de un medicamento para proporcionar una molécula terapéutica a un animal que lo necesite. 13. Utilización según la reivindicación 12, en la que el complejo de liposoma puede ser administrado sistémicamente. 14. Utilización según la reivindicación 12, en la que el complejo de liposoma puede ser administrado intravenosamente. 15. Utilización según la reivindicación 12, en la que el complejo de liposoma comprende un fragmento de anticuerpo de cadena única. 16. Utilización según la reivindicación 12, en la que el animal padece cáncer. 18 ES 2 366 100 T3 19 ES 2 366 100 T3 ES 2 366 100 T3 21 ES 2 366 100 T3 22 ES 2 366 100 T3 23 ES 2 366 100 T3 24 ES 2 366 100 T3 ES 2 366 100 T3 26 ES 2 366 100 T3 27