Haptenos, usos y método inmunoquímico para la detección de bromopropilato.

La presente invención se refiere a varios haptenos derivados de bromopropilato (BP), sus usos para la síntesis de inmunoreactivos así como un método inmunoquímico para la detección y/o cuantificación de bromopropilato (BP) y sus respectivos kits. La estructura química de los haptenos empleados, tanto para la inmovilización en el soporte sólido como para la inmunización de animales para obtener los respectivos anticuerpos policlonales, se ha diseñado para maximizar el reconocimiento del grupo bis-bromofenil del BP por parte de los anticuerpos generados. El método de la presente invención se refiere a un análisis inmunoquímico indirecto capaz de detectar BP con un umbral de 0.14 {mi}g·L-1 y pesticidas relacionados que contienen un grupo bis-halofenil en su estructura. Además, el BP se puede analizar directamente en muestras de vino

Haptenos, usos y método inmunoquímico para la detección de bromopropilato.

La presente invención se refiere a varios haptenos derivados de bromopropilato (BP), sus usos para la síntesis de inmunoreactivos así como un método inmunoquímico para la detección y/o cuantificación de bromopropilato (BP) y sus respectivos kits. La estructura química de los haptenos empleados, tanto para la inmovilización en el soporte sólido como para la inmunización de animales para obtener los respectivos anticuerpos policlonales, se ha diseñado para maximizar el reconocimiento del grupo bis-bromofenil del BP por parte de los anticuerpos generados. El método de la presente invención se refiere a un análisis inmunoquímico indirecto capaz de detectar BP con un umbral de 0.14 μg•L-1 y pesticidas relacionados que contienen un grupo bis-halofenil en su estructura. Además, el BP se puede analizar directamente en muestras de vino.

Estado de la técnica anterior

En los últimos años se viene detectando la presencia de residuos de pesticidas en frutas y verduras. El consumo de estos alimentos supone un claro peligro potencial sobre los seres humanos y el ambiente.

El bromopropilato (BP) es un miticida de contacto que se ha utilizado extensivamente en agricultura contra todas las etapas del ciclo de vida de los ácaros, por ejemplo, de las familias Eriophyidae, Tenuipalpidae o de Tetranychidae. El BP es un compuesto no sistémico y no penetrante que permanece en la cáscara de frutas y no emigra en la pulpa. Por otra parte, el BP es bastante persistente en el ambiente en medios ácidos (50 días de vida media) y neutrales (más de 3 años de vida media. El BP tiene toxicidad aguda baja en las ratas y los conejos. Sin embargo, los efectos del BP sobre seres humanos son desconocidos. El INCHEM (International programme on chemical safety) establece una ingesta diaria aceptable de entre 0-0.03 mg/kg en seres humanos. El BP fue probado en primer lugar en 1966 para el control de ácaros. Hoy en día, el uso de BP ha sido prohibido en el Reino Unido. En varios Estados de la Unión Europea se permite mantener el uso autorizado de BP hasta 2008, mientras que se buscan alternativas (regulación 2076/2002/EC). El nivel de residuo máximo temporal (MRLs) en productos tales como uvas para vinificación, cítricos y manzanas (2 mg•Kg-1) se ha establecido de acuerdo con la Directiva 90/642/EEC. Sin embargo, los datos de la Comisión Europea demuestran que todavía hay un uso continuo de BP en viñedos ya que se han encontrado residuos de BP en Noruega, Islandia, Dinamarca, Italia y Lichtenstein en uvas de mesa con los niveles de residuo que excedían los MRLs (COMMUNITIES, C. O. T. E., Monitoring of Pesticide Residues in Products of Plant Origin in the European Union, Norway, Iceland, Denmark, Italy and Liechtenstein. En DOCUMENT, C. S. W., Ed. 2005).

El procedimiento clásico usado para detectar y/o para cuantificar este tipo de compuestos incluye su extracción y separación de otras sustancias potencialmente de interferencia de la muestra biológica y la cuantificación posterior por análisis instrumental. Aunque los métodos analíticos convencionales ofrecen límites de detección a nivel de partes por billón (ppb), requieren de instrumentación cara y personal especializado para poder llevar a cabo las detecciones y/o cuantificaciones. Además, este tipo de métodos pueden sufrir pérdidas en la recuperación del compuesto que se desea analizar.

Para garantizar la calidad de la fruta y verdura, se analiza el BP mediante técnicas cromatográficas tales como cromatografía líquida de alto rendimiento (Martel y Zeggane (2002). J. Chromatog. A. 954(1-2): 173-180), cromatografía de gas (Lee y Kennedy (2001). J. AOAC Int. 84(5): 1393-1406) o cromatografía gaseosa-espectrometría de masa (Liapis et al. (2003). J. Chromatog. A. 996(1-2):181-187). Estas técnicas tienen límites de detección alrededor de los MRLs. Sin embargo, una desventaja importante de estos procedimientos es que requieren un método de extracción complejo tal como extracción líquida, sólido-fase o microextracción sólido-fase antes del análisis. Consecuentemente, las técnicas cromatográficas requieren un tiempo considerable, el instrumental necesario es caro y el personal debe estar muy especializado.

Se han desarrollado immunoensayos para la detección de pesticidas y otros agentes contaminantes ambientales, tales como insecticidas organofosforados (Lee et al. (1995). J. Agric. Food Chem. 43(6): 1730-1739). No obstante, hasta el presente, no existe ningún método ni los reactivos necesarios para la detección de BP mediante inmunoensayos. Para conseguirlos se requiere un complejo y no descrito proceso de síntesis de aquellos derivados que puedan presentarse en la naturaleza de forma que se puedan detectar de forma específica y con un bajo umbral de detección.

Explicación de la invención

La presente invención se refiere a un conjunto de haptenos estructuralmente relacionados, desde el punto de vista químico, con el bromopropilato (BP) y otros compuestos de esta familia de pesticidas y sus intermedios de síntesis y de degradación medioambiental, sus usos para la síntesis de inmunoreactivos así como un método inmunoquímico para la detección y/o cuantificación de bromopropilato (BP). El método de la presente invención está basado en la síntesis de derivados de BP (en adelante, haptenos) y anticuerpos policlonales específicos. La estructura química de los haptenos empleados, tanto para la inmovilización en el soporte sólido como para la inmunización de animales para obtener los respectivos anticuerpos policlonales, fue diseñada para maximizar el reconocimiento del grupo bis-halofenilmetilen del BP. Para producir respuesta inmunológica en el animal, se conjugaron los diferentes haptenos sintetizados a diversas proteínas. Por tanto, el método de la presente invención se refiere a la detección y/o cuantificación inmunológica indirecta capaz de detectar BP con un umbral de 0.14 μg•L-1. Los estudios en la selectividad de este immunoensayo han demostrado un alto reconocimiento de los pesticidas relacionados que contienen un grupo bis-halofenilmetilen en su estructura. Otros pesticidas no interfieren en el análisis de BP usando esta técnica inmunoquímica. Además, tal como se demuestra en el ejemplo correspondiente, el BP se puede analizar directamente en muestras de vino sin la necesidad de un procedimiento de limpieza de aplicar el método.

En este sentido, un primer aspecto de la presente invención se refiere a un hapteno de bromopropilato (BP) de fórmula general I

Donde

X es un halógeno seleccionado de entre Cl, Br, I ó F;

R₁ se selecciona de entre Cl, Br, OH ó O-(CH₂)_n-Rg;

Y es O ó NH y

cuando Y es O, R₂ es H o alquilo (C₁-C₄) y

cuando Y es NH, R₂ es -(CH₂)_n-Rg;

donde n toma valores de entre 2 a 4 y Rg se selecciona de entre OH, CHO, COOH, NH₂ o SH. Cuando R₁ es O-(CH₂)_n-Rg, Rg también puede ser -OCOCH₂I.

En la presente invención se entiende por "halógeno" un átomo de Bromo (Br), Cloro (Cl), yodo (I) o flúor (F). Preferiblemente el halógeno es Br y más preferiblemente, en el hapteno de fórmula general (I), el halógeno(X) es Br. Los sustituyentes de los arilos (X) están preferiblemente situados en posición para de ambos anillos. Por lo que preferiblemente, los haptenos de la presente invención presentan la fórmula general (II):

El término "alquilo" se refiere, en la presente invención, a cadenas alifáticas, lineales o ramificadas, que tienen de 1 a 6 átomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, terc-butilo, sec-butilo, n-pentilo, n-hexilo, etc. Preferiblemente el grupo alquilo tiene entre 1 y 4 átomos de carbono. Más preferiblemente es metilo o isopropilo (i-propilo).

Según otra realización preferida, Y es O y R₂ es un grupo metil o isopropilo.

En otra realización preferida, Y es NH y R₂ es -(CH₂)₃-COOH.

Según una realización... [Seguir leyendo]

1. Hapteno de bromopropilato (BP) de fórmula general I

Donde

X es un halógeno seleccionado de entre Cl, Br, I ó F;

R₁ se selecciona de entre Cl, Br, OH ó O-(CH₂)_n-Rg; donde n toma valores de entre 2 a 4 y Rg se selecciona de entre OH, CHO, COOH, NH₂ SH o OCOCH₂I,

Y es O ó NH y

cuando Y es O, R₂ es H o alquilo (C₁-C₄) y

cuando Y es NH, R₂ es -(CH₂)_n-Rg; donde n toma valores de entre 2 a 4 y Rg se selecciona de entre OH, CHO, COOH, NH₂ o SH.

2. Hapteno de BP según la reivindicación 1 donde X es Br.

3. Hapteno de BP según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, donde Y es O y R₂ es un grupo metil o isopropilo.

4. Hapteno de Bromopropilato (BP) según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, donde Y es NH y R₂ es -(CH₂)₃-COOH.

5. Hapteno de BP según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que se selecciona de la lista que comprende: