Método para determinar los genotipos HLA de los genes HLA HLA-A,

HLA-B, HLA-C, DRB1, DQA1, DQB1, DPA1 y DPB1 de más de un individuo en paralelo, comprendiendo dicho método: (a). en cada individuo, amplificar los exones de los genes HLA-A, HLA-B, HLA-C, DRB1, DQA1, DQB1, DPA1 y DPB1 que comprenden sitios polimórficos para obtener amplicones HLA-A, HLA-B, HLA-C, DRB1, DQA1, DQB1, DPA1, y DPB1 de cada individuo, realizándose cada reacción de amplificación con un cebador directo y un cebador inverso para amplificar un exón de gen HLA, de forma que: (i).el cebador directo comprende las siguientes secuencias, en sentido 5' a 3': una secuencia adaptador, una secuencia de identificación molecular, y una secuencia de hibridación a HLA, poseyendo dicha secuencia de hibridación a HLA una longitud entre 15 y 40 nucleótidos y siendo exacta o substancialmente complementaria a la secuencia al exón del gen HLA de interés; y (ii).el cebador inverso comprende las siguientes secuencias, en sentido 5' a 3': una secuencia adaptador, una secuencia de identificación molecular, y una secuencia de hibridación a HLA, poseyendo dicha secuencia de hibridación a HLA una longitud entre 15 y 40 nucleótidos y siendo exacta o substancialmente complementaria a la secuencia al exón del gen HLA de interés; (b). agrupar los amplicones HLA de más de un individuo y realizar una PCR en emulsión; (c). determinar la secuencia de los amplicones HLA-A, HLA-B, HLA-C, DRB1, DQA1, DQB1, DPA1, y DPB1 de cada individuo utilizando una pirosecuenciación en paralelo; y (d). asignar los alelos HLA de cada individuo comparando la secuencia de los amplicones HLA con secuencias HLA conocidas para determina qué alelos están presentes en el individuo

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los locus HLA de clase I y II son los genes más polimórficos del genoma humano, con un patrón complejo de polimorfismo en mosaico localizado fundamentalmente en el exón 2 en los genes de clase II y en los exones 2 y 3 en los genes de clase I. En los métodos actuales de tipado HLA, la resolución a nivel de alelo de los alelos HLA, elemento clínicamente importante en el caso del transplante de células madre hematopoyéticas, es técnicamente complejo. Diversos estudios a gran escala han demostrado que una compatibilidad HLA precisa a nivel de alelo entre el donante y el paciente mejora significativamente la supervivencia global del transplante al reducir la incidencia y gravedad tanto de la enfermedad del injerto contra el huésped aguda como crónica y mejorar las tasas de éxito del injerto. Cuando, por ejemplo, son compatibles 8 de 8 locus HLA de los más significativos en comparación con 6 de 8, se incrementa la supervivencia tras el transplante un 60% a los 12 meses.

Es una práctica habitual mantener registros de donantes de médula ósea en los que se tipifica en millones de donantes potenciales el HLA con una resolución baja-media de los locus A, B, y en muchos casos DRB1. En base a este tipado inicial, se seleccionan múltiples donantes no relacionados y potencialmente compatibles y a continuación se procede al tipado con resolución a nivel de alelo de estos locus y otros locus adicionales para identificar el donante más compatible con el receptor.

Hasta la fecha, la máxima resolución del tipado HLA se obtiene mediante la secuenciación del ADN basada en el método de Sanger mediante fluorescencia con la utilización de electroforesis capilar. Sin embargo, pueden persistir ambigüedades en los datos del tipado HLA debidas a la existencia de múltiples polimorfismos entre alelos y las resultantes ambigüedades de fase cuando ambos alelos se amplifican y secuencian a la vez. Resolver estas ambigüedades requiere de procedimientos de larga duración tales como amplificar y luego analizar los dos alelos por separado.

Los métodos de secuenciación de nueva generación propagan clonalmente en paralelo millones de moléculas individuales de ADN las cuales a continuación son secuenciadas en paralelo. Recientemente, las longitudes de lectura obtenibles mediante uno de estos métodos de secuenciación mediante pirosecuenciación de nueva generación (454 Life Sciences, Inc.) ha aumentado a más de 250 nucleótidos. La presente invención da a conocer métodos de genotipado HLA mejorados basados en el descubrimiento de que la secuenciación clonal puede utilizarse para fijar la fase de los polimorfismos asociados con un exón y hace posible la determinación inequívoca de la secuencia de cada alelo HLA.

BREVE RESUMEN DE LA INVENCION

La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que el genotipado HLA de 8 locus puede realizarse en muestras obtenidas de múltiples individuos en un solo ciclo de secuenciación. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la presente invención da a conocer un método para la determinación de los genotipos de los genes HLA, HLA-A, HLA-B, HLA-C, DRB1, DQA1, DQB1, DPA1, y DPB1 para más de un individuo en paralelo, comprendiendo dicho método:

(a) amplificar para cada individuo los exones de los genes HLA-A, HLA-B, HLA-C, DRB1, DQA1, DQB1, DPA1, y DPB1 que comprenden sitios polimórficos obteniendo amplicones HLA-A, HLA-B, HLA-C, DRB1, DQA1, DQB1, DPA1, y DPB1 de cada individuo, de forma que cada reacción de amplificación se realiza con un cebador directo y un cebador inverso para amplificar un exón de gen HLA, de manera que:

(i) el cebador directo comprende las siguientes secuencias, en sentido 5' a 3': una secuencia de adaptador, una secuencia de identificación molecular, y una secuencia HLA; y

(ii) el cebador inverso comprende las siguientes secuencias, en sentido 5' a 3': una secuencia de adaptador, una secuencia de identificación molecular, y una secuencia HLA;

(b) agrupar los amplicones HLA de más de un individuo y realizar una PCR en emulsión;

(c) determinar la secuencia de los amplicones HLA-A, HLA-B, HLA-C, DRB1, DQA1, DQB1, DPA1, y DPB1 de cada individuo utilizando una pirosecuenciación en paralelo; y

(d) asignar los alelos HLA de cada individuo mediante la comparación de la secuencia de los amplicones HLA con la secuencia conocida del HLA para determinar qué alelos HLA están presentes en el individuo. En realizaciones preferentes, según la presente invención, el cebador directo o inverso para amplificar el amplicón HLA posee la secuencia de la región que se hibrida con el HLA de uno de los cebadores que se

muestran en la Tabla 1. Dicho cebador puede contener adicionalmente la secuencia de una región adaptador de uno de los cebadores que se muestran en la Tabla 1. En realizaciones preferentes adicionales, el cebador también puede contener una etiqueta de identificación individual de uno de los cebadores de la Tabla 1. En realizaciones especialmente preferentes, el cebador posee la secuencia de uno de los cebadores de la Tabla 1.

Además, la invención da a conocer un kit que comprende pares de cebadores para obtener amplicones HLA para determinar los genotipos HLA de los genes HLA HLA-A, HLA-B, HLA-C, DRB1, DQA1, DQB1, DPA1, y DPB1 de más de un individuo en paralelo, en el que los pares de cebadores comprenden un cebador directo y un cebador inverso para amplificar un exón de gen HLA, de manera que: (i) el cebador directo comprende las siguientes secuencias, en sentido 5' a 3': una secuencia de adaptador, una secuencia de identificación molecular, y una secuencia HLA; y (ii) el cebador inverso comprende las siguientes secuencias, en sentido 5' a 3': una secuencia de adaptador, una secuencia de identificación molecular, y una secuencia HLA. En las realizaciones preferentes el kit comprende uno o más de los cebadores directos e inversos mostrados en la Tabla 1. En otras realizaciones preferentes, el kit comprende pares de cebadores para amplificar exones para genotipar los genes HLA HLA-A, HLAB, HLA-C, DRB1, DQA1, DQB1, DPA1, y DPB1, en el que cada par de cebadores se selecciona entre los cebadores mostrados en la Tabla1.

La presente invención da a conocer adicionalmente un kit que comprende uno o más pares de cebadores, en el que cada par de cebadores comprende un cebador directo para obtener un amplicón HLA que posee la secuencia de una región de hibridación a HLA de uno de los cebadores mostrados en la Tabla 1; y un cebador inverso para obtener un amplicón HLA que posee la secuencia de una región de hibridación a HLA de uno de los cebadores mostrados en la Tabla 1. Dicho cebador comprende adicionalmente una región adaptador que posee una de las secuencias mostradas en la Tabla 1. En realizaciones preferentes adicionales, el cebador posee una etiqueta de identificación individual de uno de los cebadores mostrados en la Tabla 1. En realizaciones especialmente preferentes, el cebador directo posee la secuencia de uno de los cebadores mostrados en la Tabla 1 y el cebador inverso posee la secuencia de uno de los cebadores mostrados en la Tabla 1.

Además, la invención da a conocer un kit, que comprende quince pares de cebadores HLA, de manera que los pares de cebadores amplifican el exón 2, el exón 3 y el exón 4 de HLA-A; el exón 2, el exón 3 y el exón 4 de HLA-B; el exón2, el exón 3 y el exón 4 de HLA-C; el exón 2 DRB1, el exón 2 DPB1, el exón 2 DPA1, el exón 2 DQA1; y el exón 2 y el exón 3 de DQB1. En realizaciones preferentes, la invención da a conocer un kit que comprende al menos seis pares de cebadores, o al menos ocho, nueve, diez, once, doce, trece o catorce pares de cebadores. Preferentemente, los pares de cebadores se seleccionan de los cebadores mostrados en la Tabla 1.

Además, la presente invención da a conocer un kit, que comprende pares de cebadores múltiples para cada par de cebadores que amplifica el exón2, el exón 3 y el exón 4 de HLA-A; el exón2, el exón 3 y el exón 4 de HLA-B; el exón2, el exón 3 y el exón 4 de HLA-C; el exón 2 DRB1, el exón 2 DPB1, el exón 2 DPA1, el exón 2 DQA1; y el exón 2 y el exón 3 de DQB1, en el que los pares de cebadores múltiples que amplifican una región exónica individual de interés posee la misma región de hibridación con el HLA y la misma región adaptador, pero etiquetas de identificación diferentes. En realizaciones preferentes, existen 12 o más pares de cebadores múltiples para cada región exónica de interés, teniendo los pares de cebadores etiquetas de identificación múltiple diferentes.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS... [Seguir leyendo]

1. Método para determinar los genotipos HLA de los genes HLA HLA-A, HLA-B, HLA-C, DRB1, DQA1, DQB1, DPA1 y DPB1 de más de un individuo en paralelo, comprendiendo dicho método:

(a). en cada individuo, amplificar los exones de los genes HLA-A, HLA-B, HLA-C, DRB1, DQA1, DQB1, DPA1 y DPB1 que comprenden sitios polimórficos para obtener amplicones HLA-A, HLA-B, HLA-C, DRB1, DQA1, DQB1, DPA1, y DPB1 de cada individuo, realizándose cada reacción de amplificación con un cebador directo y un cebador inverso para amplificar un exón de gen HLA, de forma que:

(i).el cebador directo comprende las siguientes secuencias, en sentido 5' a 3': una secuencia adaptador, una secuencia de identificación molecular, y una secuencia de hibridación a HLA, poseyendo dicha secuencia de hibridación a HLA una longitud entre 15 y 40 nucleótidos y siendo exacta o substancialmente complementaria a la secuencia al exón del gen HLA de interés; y

(ii).el cebador inverso comprende las siguientes secuencias, en sentido 5' a 3':

una secuencia adaptador, una secuencia de identificación molecular, y una secuencia de hibridación a HLA, poseyendo dicha secuencia de hibridación a HLA una longitud entre 15 y 40 nucleótidos y siendo exacta o substancialmente complementaria a la secuencia al exón del gen HLA de interés;

(b). agrupar los amplicones HLA de más de un individuo y realizar una PCR en emulsión;

(c). determinar la secuencia de los amplicones HLA-A, HLA-B, HLA-C, DRB1, DQA1, DQB1, DPA1, y DPB1 de cada individuo utilizando una pirosecuenciación en paralelo; y

(d). asignar los alelos HLA de cada individuo comparando la secuencia de los amplicones HLA con secuencias HLA conocidas para determina qué alelos están presentes en el individuo.

2. Método, según la reivindicación 1, en el que el cebador directo para obtener un amplicón HLA posee la secuencia de la región de unión a HLA de uno de los cebadores mostrados en la tabla 1.

3. Método, según la reivindicación 2, en el que el cebador directo posee una secuencia de uno de los cebadores mostrados en la tabla 1.

4. Método, según la reivindicación 1, en el que el cebador inverso para obtener un amplicón HLA posee la secuencia de la región de unión a HLA de uno de los cebadores mostrados en la tabla 1.

5. Método, según la reivindicación 4, en el que el cebador inverso posee una secuencia de uno de los cebadores mostrados en la tabla 1.

6. Método, según la reivindicación 1, en el que el cebador directo para obtener un amplicón HLA posee la secuencia de la región de unión a HLA de uno de los cebadores mostrados en la tabla 1; y el cebador inverso para obtener un amplicón HLA posee la secuencia de la región de unión a HLA de uno de los cebadores mostrados en la tabla 1.

7. Método, según la reivindicación 6, en el que el cebador directo posee la región adaptador de uno de los cebadores mostrados en la tabla 1; y el cebador inverso posee la región adaptador de uno de los cebadores mostrados en la tabla 1.

8. Método, según la reivindicación 1, en el que el cebador directo posee la etiqueta de identificación individual de uno de los cebadores mostrados en la tabla 1, y el cebador inverso posee la etiqueta de identificación individual de uno de los cebadores mostrados en la tabla 1.

9. Método, según la reivindicación 1, en el que la PCR en emulsión se realiza asimétricamente.

10. Kit que comprende pares de cebadores para obtener amplicones HLA para determinar genotipos de los genes HLA-A, HLA-B, HLA-C, DRB1, DQA1, DQB1, DPA1, y DPB1 de más de un individuo en paralelo, en el que los pares de cebadores comprenden un cebador directo y un cebador inverso para amplificar un exón de gen HLA, en el que: (i) el cebador directo comprende las siguientes secuencias, en sentido 5' a 3': una secuencia adaptador, una secuencia de identificación molecular, y una secuencia de hibridación a HLA, poseyendo dicha secuencia de hibridación a HLA una longitud entre 15 y 40 nucleótidos y siendo exacta o substancialmente complementaria a la secuencia al exón del gen HLA de interés; y (ii) el cebador inverso comprende las siguientes secuencias, en sentido 5' a 3': una secuencia adaptador, una secuencia de identificación molecular, y una secuencia de hibridación a HLA, poseyendo dicha secuencia de hibridación a HLA una longitud entre 15 y

40 nucleótidos y siendo exacta o substancialmente complementaria a la secuencia al exón del gen HLA de interés.

11. Kit, según la reivindicación 10, en el que los pares de cebadores comprenden cebadores directos e inversos de 5 los mostrados en la tabla 1.

12. Kit que comprende uno o más pares de cebadores, en el que cada par de cebadores comprende un cebador directo para obtener un amplicón HLA que posee la secuencia de unión a HLA de uno de los cebadores mostrados en la tabla 1; y el cebador inverso para obtener un amplicón HLA que posee la secuencia de unión a

10 HLA de uno de los cebadores mostrados en la tabla 1.

13. Kit, según la reivindicación 12, en el que el cebador directo posee una secuencia de uno de los cebadores mostrados en la tabla 1; y el cebador inverso posee una secuencia de uno de los cebadores mostrados en la tabla 1.

14. Kit, según la reivindicación 12, en el que el kit comprende quince pares de cebadores HLA, en el que los pares de cebadores amplifican el exón 2, el exón 3 y el exón 4 de HLA-A, el exón 2, el exón 3 y el exón 4 de HLA-B; el exón 2, el exón 3 y el exón 4 de HLA-C, el exón 2 de DRB1, el exón 2 de DPB1, el exón 2 de DPA1, el exón 2 de DQA1; y el exón 2 y el exón 3 de DQB1.