Una formulación para la liberación de una molécula de ácido nucleico en una célula,

que comprende un ácido nucleico y un polímero aniónico, donde el polímero aniónico es poli(ácido glutámico); y donde el ácido nucleico formulado no está encapsulado y no está condensado

Introducción

Esta invención se refiere a nuevas composiciones para la introducción de una molécula de ácido nucleico en una célula, incluyendo por medio de un método de liberación por voltaje de pulsos, para la expresión de una proteína, un péptido, un ARN antisentido, una ribozima, o un polipéptido.

Antecedentes de la Invención

La siguiente información se presenta para ayudar a la comprensión del lector.

La terapia génica es un área principal de la investigación en el desarrollo de fármacos. La terapia génica ha sido considerada un mecanismo deseable para corregir las enfermedades determinadas genéticamente resultantes del fracaso en la producción de ciertas proteínas y las enfermedades adquiridas tales como las autoinmunitarias y el cáncer. Un ejemplo de una clase de enfermedades determinadas genéticamente que son consideradas susceptibles de terapia génica es la hemofilia. La hemofilia B, por ejemplo, es un trastorno hemorrágico que resulta de la ausencia de factor de coagulación sanguíneo IX funcional ("F. IX"). La dolencia se clasifica como grave, moderada o leve, dependiendo del nivel de F. IX funcional (Lusher, J. M. (1999) Thromb Haemost 82: 572-5751). Aproximadamente 5.200 varones resultan afectados por esta enfermedad en los Estados Unidos siendo aproximadamente el 45% de estos casos de tipo grave. En los casos graves de hemofilia B (<1% de los niveles de

F. IX normal) se producen frecuentes eventos de hemorragia que pueden poner en peligro la vida y producen a menudo una destrucción debilitante de las articulaciones del paciente. La terapia actual para la hemofilia B es la administración de la proteína F. IX solamente en respuesta a los eventos hemorrágicos. El uso de cualquier derivado de la sangre o de F. IX recombinante ha demostrado que se pueden lograr beneficios clínicos y de calidad de vida tremendos convirtiendo los casos de hemofilia B más graves en moderados o leves. En algunos países se administra la proteína F. IX profilácticamente en los casos más graves, a pesar del hecho de que estos tratamientos son extremadamente costosos (Ljung, R. C. (1999) Thromb Haemost 82 525 - 530). El uso profiláctico de F. IX no es frecuente en los Estados Unidos.

La terapia génica podría proporcionar un nuevo enfoque profiláctico para el tratamiento de enfermedades tales como la hemofilia B. Un obstáculo tecnológico para la comercialización de la terapia génica, no obstante, es la necesidad de métodos de liberación génica prácticos, eficaces y seguros. En modelos animales de hemofilia, se han utilizado con éxito vectores basados en virus para administrar el gen del F. IX humano en el hígado o el músculo. (Kay, M. A., et al. (1993) Science 262: 117-119; Herzog, R. W., et al. (1999) Nat Med: 56-63; Snyder, R. O., et al. (1999) Nat Med 5: 64-70; Chao, H., et al. (1999) Gene Ther 6: 1695-1704; Lozier, J. N., et al. (1999) Blood 94: 39683975; Kaufman, R. J. (1999) Hum Gene Ther 10: 2091 - 2107). En algunos casos, estos enfoques han conducido a la expresión a largo plazo (> 2 años) de niveles terapéuticos de F. IX en un modelo canino de hemofilia B (Herzog,

R. W., et al. (1999) Nat Med 5: 56-63). No obstante, se ha informado extensamente sobre las limitaciones de los enfoques basados en virus. Por ejemplo, no es posible la re-administración con estos vectores debido a la respuesta inmunitaria humoral generada contra las proteínas virales. Además de los retos de la fabricación para obtener un suministro de vectores reproducibles adecuados, también existen asuntos de seguridad significativos asociados con los vectores virales, concretamente para aquellos que se dirigen al hígado para la expresión del gen. A pesar de los problemas asociados con la terapia génica viral, muchos han considerado que los virus son más eficaces que los vehículos de liberación no virales.

Un problema de la terapia génica no viral es conseguir la liberación y expresión de suficiente ácido nucleico para producir una expresión fisiológicamente relevante, tangible. Aunque hace varios años se demostró que los plásmidos con ADN en solución salina isotónica (también denominados ADN "desnudo") transfectaban una variedad de células in vivo, la carencia de estabilidad de tales plásmidos no protegidos a la degradación enzimática está asociada con la irreproducibilidad de la absorción que conduce a una expresión altamente variable y a respuestas biológicas en modelos animales. La biodisponibilidad muy baja del plásmido "desnudo" en la mayoría de los tejidos también requiere la administración de dosis elevadas de plásmidos para generar una respuesta farmacológica.

Por lo tanto el campo de la liberación génica no viral se ha dirigido a sistemas de liberación sintéticos más eficaces capaces de aumentar la eficacia de liberación del plásmido, conferir una expresión prolongada y proporcionar formulaciones estables en el almacenamiento como se espera de otras formulaciones farmacéuticas.

Para superar el problema de la degradación de los ácidos nucleicos, por lo general el ADN plasmídico ("ADNp"), e intensificar la eficacia de la transfección de genes, se han desarrollado agentes condensantes catiónicos (tales como polibreno, dendrímeros, quitosana, lípidos y péptidos) para proteger el ADNp condensándolo por medio de la interacción electrostástica. (A. P. Rolland, From genes to gene medicines: recent advances in nonviral gene delivery, revisado en Therapeutic drug carrier systems, 15 (2): 143-198 (1998).) Sin embargo, el uso de partículas plasmídicas condensadas para la transfección de un gran número de células musculares in vivo no ha resultado satisfactorio comparado directamente con el ADN "desnudo". Wolff, J. A., et al., J. Cell Sci., 103, 1249, 1992. En particular, debido a la fisiología del músculo, el uso de partículas condensadas rígidas que contienen un plásmido para la transfección eficaz de un gran número de células musculares no ha resultado satisfactorio hasta la fecha porque los lípidos catiónicos y los complejos de plásmidos con polilisina no cruzan la lámina externa para conseguir el acceso a las caveolas y los túbulos T. Id.

Otras estrategias que incluyen la modulación de la carga superficial y el carácter hidrófobo del plásmido mediante la interacción con sistemas no condensantes interactivos, protectores (p. ejemplo, polímeros PINC®) han mostrado ventajas sobre el uso del ADN "desnudo" para la administración directa a tejidos sólidos. [Documento WO 9621470, Patente de los Estados Unidos Núm. 6.040.295].

También se han utilizado microesferas biodegradables en la liberación génica que encapsulan el ácido nucleico. Por ejemplo, en el documento WO 0078357, Chen, W. et al, describieron matrices, películas, geles e hidrogeles que incluyen ácido hialurónico (AH) derivatizado con una hidrazida y entrecruzado con un ácido nucleico que forman microesferas de liberación lenta. En el documento WO 9524929, Boekelheide, K. et al., describieron la encapsulación de genes en una matriz preferiblemente en forma de una micropartícula tal como una microesfera, una microcápsula, una película, un implante, o un revestimiento sobre un dispositivo tal como un stent. En el documento US 6048551, Beer, S. et al. describieron un sistema de reparto de genes de liberación controlada utilizando poli(lactida-co-glicólido) (PLGA), ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa, ftalatoacetato de celulosa, y las series R, L y E de Ludragit de microesferas de polímeros y copolímeros para encapsular el vector del gen. Luo D et al. Pharm Res 1999 Agosto; 16 (8): 1300-8, informaron sobre la caracterización de sistemas para la liberación controlada de ADN procedente de matrices poliméricas implantables (EVAc: poli(etileno-co-acetato de vinilo)) y microesferas inyectables (PLGA y PLA: copolímero de poli(D,L-lactida-co-glicólido) y poli(L-lactida), respectivamente). A pesar de su promesa, las microesferas pueden plantear dificultades de fabricación y pueden restringir adversamente la liberación de ADN in vivo, concretamente en tejido muscular.

Otra técnica anterior incluye Blood, 96, 803a, Nov. 2000, que describe una polivinilpirrolidona combinada con ácido nucleico, y un poliglutamato combinado con ácido nucleico, y donde junto con la electroporación, se logra una liberación de genes satisfactoria, y Pharmaceutical Development Technology, 5, 2000, 115-22, que describe la hibridación de ácidos nucleicos, y la capacidad de los carbohidratos para proteger los ácidos nucleicos de la degradación en tales condiciones.

1. Una formulación para la liberación de una molécula de ácido nucleico en una célula, que comprende un ácido nucleico y un polímero aniónico, donde el polímero aniónico es poli(ácido glutámico); y donde el ácido nucleico formulado no está encapsulado y no está condensado.

2. Una formulación para la liberación de una molécula de ácido nucleico en una célula, que comprende un ácido nucleico y un polímero aniónico, donde el polímero aniónico es poli(ácido aspártico) o una de sus sales; y donde el ácido nucleico formulado no está encapsulado y no está condensado.

3. Una formulación para la liberación de una molécula de ácido nucleico en una célula, que comprende un ácido nucleico y un polímero aniónico, donde el polímero aniónico es un polímero que consiste en ácido glutámico y ácido aspártico o sus sales; y donde el ácido nucleico formulado no está encapsulado y no está condensado.

4. Una formulación como se reivindica en la reivindicación 1, donde

(a) el poli(ácido glutámico) es poli(ácido L-glutámico) y se caracteriza por un peso molecular en el intervalo de 2.000 a 100.000 Daltons; o

(b) el poli(ácido glutámico) es poli(ácido D-glutámico) y se caracteriza por un peso molecular en el intervalo de

15.000 a 100.000 Daltons.

5. Una formulación como se reivindica en las reivindicaciones 1 o 2, donde el poli(ácido glutámico) o el poli(ácido aspártico) se caracterizan por un peso molecular en el intervalo de 15.000 a 50.000 Daltons.

6. Una formulación como se reivindica en las reivindicaciones 1 o 2, donde

(a) el poli(ácido glutámico) es poli(ácido L-glutámico) y se caracteriza por un peso molecular en el intervalo de 2.000 a 15.000 Daltons; o

(b) el poli(ácido aspártico) se caracteriza por un peso molecular en el intervalo de 2.000 a 15.000 Daltons.

7. Una formulación como se reivindica en la reivindicación 1, donde el poli(ácido glutámico) se caracteriza por un peso molecular en el intervalo de 50.000 a 100.000 Daltons.

8. Una formulación como se reivindica en la reivindicación 2, donde el poli(ácido aspártico) se caracteriza por un peso molecular en el intervalo de 50.000 a 100.000 Daltons.

9. Una formulación como se reivindica en la reivindicación 1, 2 o 3, donde la formulación es isotónica.

10. Una formulación como se reivindica en la reivindicación 1, 2 o 3, donde el polímero aniónico aumenta la liberación del ácido nucleico en la célula in vivo.

11. Una formulación como se reivindica en la reivindicación 10, donde el polímero aniónico aumenta la liberación del ácido nucleico en una célula de un tejido muscular in vivo.

12. Una formulación como se reivindica en la reivindicación 10, donde el polímero aniónico aumenta la liberación del ácido nucleico en múltiples líneas celulares in vivo.

13. Una formulación como se reivindica en la reivindicación 1, 2 o 3, donde el polímero aniónico confiere estabilidad al ácido nucleico durante las condiciones de almacenamiento seleccionadas del grupo que consiste en: almacenamiento en líquido, liofilización y congelación.

14. Una formulación como se reivindica en la reivindicación 1, 2 o 3, donde la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia que codifica una proteína seleccionada del grupo que consiste en hormonas, hormona del crecimiento humana, factores de crecimiento, citoquinas, y factores antigénicos.

15. Una formulación como se reivindica en la reivindicación 14, donde la proteína es el factor IX.

16. Una formulación como se reivindica en la reivindicación 14, donde el factor de crecimiento es una eritropoyetina.

17. Una formulación como se reivindica en la reivindicación 14, donde la citoquina es un interferón alfa o un interferón beta.

18. Una formulación como se reivindica en la reivindicación 1, 2 o 3, que comprende adicionalmente un tampón adecuado para la administración interna.

19. Una formulación como se reivindica en la reivindicación 18, que comprende el ácido nucleico formulado con poli-L-glutamato a una concentración de aproximadamente 6 mg/ml y NaCl aproximadamente 150 mM.

20. Una formulación como se reivindica en la reivindicación 19, donde el ácido nucleico está presente en la formulación a aproximadamente 1 mg/ml.

21. Una formulación como se reivindica en la reivindicación 1, 2 o 3, que está liofilizada.

22. Una formulación como se reivindica en la reivindicación 1, donde el poli(ácido glutámico) es poli(ácido Lglutámico).

23. Una formulación como se reivindica en la reivindicación 1, 2 o 3, donde la composición se almacena en un estado liofilizado y se reconstituye antes de su administración.

24. Una formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, para su uso en la introducción de un ácido nucleico en un tejido de un mamífero.

25. Una formulación como se reivindica en la reivindicación 24, donde el ácido nucleico es introducido por medio de inyección.

26. Una formulación como se reivindica en la reivindicación 24, donde el nivel en sangre de una proteína terapéutica se incrementa en un mamífero; el ácido nucleico es un vector no viral que codifica una proteína terapéutica; la formulación se introduce en el tejido del mamífero in vivo; y el tejido se somete a electroporación, donde el polímero aniónico aumenta la transfección del vector no viral junto con la electroporación del tejido.

27. Una formulación como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26, donde dicho tejido es el músculo.

28. Una formulación como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 24 a 27, donde la formulación es liofilizada, almacenada y después re-hidratada antes de introducir el medicamento en un tejido de mamífero.

29. Una formulación como se reivindica en la reivindicación 24, donde dicho tejido es un tumor.

30. Una formulación como se reivindica en la reivindicación 24, donde la introducción del ácido nucleico comprende adicionalmente la etapa de someter a electroporación el tejido.

31. Una formulación como se reivindica en la reivindicación 31, donde la electroporación se realiza por medio del uso de un dispositivo configurado y fijado para ocasionar la liberación de voltaje de pulsos de dicho ácido nucleico.

32. Una formulación como se reivindica en la reivindicación 24, donde dicha introducción del ácido nucleico induce una respuesta inmunitaria.

33. Una composición para la liberación génica in vivo que comprende una formulación de la reivindicación 1, 2 o 3, donde el ácido nucleico codifica un producto génico.

34. Una composición como se reivindica en la reivindicación 33, donde dicho producto génico comprende una proteína terapéutica.

35. Una composición como se reivindica en la reivindicación 33, donde dicho producto génico comprende un antígeno.

36. Una composición como se reivindica en la reivindicación 33, donde el ácido nucleico codifica una molécula de eritropoyetina.

37. Una composición como se reivindica en la reivindicación 33, donde el ácido nucleico codifica el Factor

IX.

38. Una composición como se reivindica en la reivindicación 33, donde el ácido nucleico codifica una citoquina.

39. Una formulación como se reivindica en la reivindicación 24, para su uso en un método de tratamiento de un mamífero que padece cáncer o una enfermedad infecciosa y la formulación se proporciona a células de dicho mamífero por medio del uso de un dispositivo configurado y fijado para la liberación por voltaje de pulsos de dicho ácido nucleico a las células del mamífero, donde dicho ácido nucleico codifica un antígeno canceroso o un antígeno para dicha enfermedad infecciosa.

40. Un kit que comprende un contenedor, cuyo contenedor comprende una formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23 y o bien (i) un dispositivo de voltaje de pulsos para liberar dicha composición en las células de un organismo, donde dicho dispositivo de voltaje de pulsos es susceptible de ser combinado con dicho contenedor, o bien (ii) instrucciones que expliquen cómo liberar dicha composición con dicho dispositivo de voltaje de pulsos.

41. Un método para elaborar un kit de la reivindicación 40, que comprende las etapas de combinar un contenedor que comprende una formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23 o bien con (i) un dispositivo de voltaje de pulsos para liberar dicha composición en las células del organismo, donde dicho dispositivo de voltaje de pulsos es susceptible de ser combinado con dicho contenedor, o bien (ii) instrucciones que explican cómo liberar dicha composición con dicho dispositivo de voltaje de pulsos.

42. Una formulación como se reivindica en la reivindicación 39, donde dicho antígeno canceroso es MAGE I, y dicho cáncer es el melanoma.

43. Una formulación como se reivindica en la reivindicación 39, donde dicho antígeno de una enfermedad infecciosa es el antígeno núcleo del HBV, y dicha enfermedad infecciosa es la hepatitis crónica.

44. Una composición farmacéutica para incrementar el nivel de una proteína terapéutica en sangre que comprende la formulación de la reivindicación 1, 2 o 3, donde el ácido nucleico es un vector no viral que codifica la proteína terapéutica.

45. Una composición farmacéutica como se reivindica en la reivindicación 44, donde el polímero aniónico aumenta la transfección junto con la electroporación in vivo.

46. Una composición farmacéutica como se reivindica en la reivindicación 44, donde el poli(ácido glutámico) es un poli-L-glutamato.

47. Una composición farmacéutica como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 44 a 46, donde la proteína terapéutica es un factor de crecimiento o una citoquina.

48. Una composición farmacéutica como se reivindica en la reivindicación 47, donde la proteína terapéutica se selecciona del grupo que consiste en: Factor IX; EPO; e IFN-alfa.

49. Una composición farmacéutica estabilizada como se reivindica en la reivindicación 44, donde el polímero aniónico protege el vector de la degradación biológica inducida por liofilización o congelación.

50. Una composición farmacéutica estabilizada de la reivindicación 49, donde el polímero aniónico es un poli-glutamato.

51. Una composición farmacéutica para ser administrada a un organismo, que comprende una formulación de la reivindicación 1, 2 o 3, donde el ácido nucleico es un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica hFIX.

52. Una composición farmacéutica como se reivindica en la reivindicación 51, donde el vector comprende adicionalmente una UTR 5' de 107 pb, un intrón sintético de 117 pb, un origen de replicación de PUC12, y un gen de resistencia a kanamicina.

53. Una composición farmacéutica como se reivindica en la reivindicación 51, donde el polímero aniónico es poli(ácido glutámico).

54. Una composición farmacéutica como se reivindica en la reivindicación 53, donde

(a) el poli(ácido glutámico) es poli(ácido L-glutámico) y se caracteriza por un peso molecular en el intervalo de 2.000 a 100.000 Daltons; o

(b) el poli(ácido glutámico) es poli(ácido D-glutámico) y se caracteriza por un peso molecular en el intervalo de

15.000 a 100.000 Daltons.

55. Una composición farmacéutica como se reivindica en la reivindicación 53, donde el poli(ácido glutámico) se caracteriza por un peso molecular en el intervalo de 15.000 a 50.000 Daltons.

56. Una composición farmacéutica como se reivindica en la reivindicación 53, donde el poli(ácido glutámico) es poli(ácido L-glutámico) y se caracteriza por un peso molecular en el intervalo de 2.000 a 15.000 Daltons.

57. Una composición farmacéutica como se reivindica en la reivindicación 53, donde el poli(ácido glutámico) se caracteriza por un peso molecular en el intervalo de 50.000 a 100.000 Daltons.

58. Una composición farmacéutica como se reivindica en la reivindicación 51, donde la formulación es isotónica.