Una composición farmacéutica que comprende IL-7 y uno o más vehículos,

excipientes o diluyentes farmacéuticamente compatibles o aceptables, en la que al menos 98% en peso de la cantidad total de IL-7 en la composición consiste en un confórmero de IL-7 que comprende los siguientes tres puentes disulfuro: Cys: 1-4 (Cys2-Cys92); 2-5 (Cys34-Cys129); y 3-6 (Cys47-Cys141)

Fármaco de IL-7. composición que comprende IL-7, preparación y usos de los mismos.

La presente invención se refiere, en general, a los campos de la inmunología y de la biología molecular. La invención describe, más concretamente, nuevas sustancias fármaco de interleuquina-7 mejoradas, los correspondientes anticuerpos inmunorreactivos específicos, así como composiciones que los comprenden, su preparación y usos. La invención también describe métodos para caracterizar el perfil de impurezas de una sustancia fármaco de r-hIL-7 utilizada para objetivos terapéuticos, así como secuencias de nucleótidos optimizadas que codifican una IL-7 de mamífero, vectores de expresión recombinantes y métodos para preparar y purificar dichos polipéptidos.

Antecedentes de la invención

Los linfocitos B y T son las principales células efectoras de las respuestas inmunológicas. Se considera que ambas clases de células se derivan, en último término, de células pluripotenciales hematopoyéticas en la médula ósea de mamíferos, a través de células progenitoras o precursoras que representan etapas distinguibles en la diferenciación de cada clase. Las células T maduras se desarrollan principalmente en el timo, supuestamente a partir de una célula precursora que migra desde la médula ósea hacia el timo en una etapa temprana del desarrollo del linfocito T. Muchos factores están activos en células B y T periféricas maduras, incluyendo IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, gamma-interferón, BSF-2, neuroleuquina, factor transformante del crecimiento-beta e IL-7 (documento EP0314415).

"Interleuquina-7" o "IL-7" hace referencia a una glicoproteína secretora endógena de mamíferos que es capaz de inducir la proliferación de progenitores y precursores de linfocitos derivados de la médula ósea, incluyendo los precursores especializados conocidos como precélulas B. Derivada originalmente del elemento estromático de una línea celular de médula ósea, la IL-7 también es segregada por células del timo, células epiteliales intestinales, queratinocitos y, en general, todos los tejidos linfoides. El documento EP0314415 describe proteínas de interleuquina-7 de mamífero y ADN que codifican dichas proteínas. La IL-7 humana madura (r-hIL-7), exclusiva de glicosilación, producida en Escherichia coli, que se describe en el documento EP0314415, tiene un peso molecular de 17.387 daltons y muestra una alta actividad in vitro en bioensayos específicos basados en la proliferación de diversas poblaciones de linfocitos. Otras denominaciones para esta molécula son "factor del crecimiento de precélulas B" y "linfoproyetina-1". En efecto, originariamente la IL-7 se describió como una citoquina cuya actividad principal era la inducción de la proliferación de precursores de células B (Namen A.E. et al., Journal of Experimental medicine, 1988, 167: 988-1002). En fechas más recientes, se ha indicado que la IL-7 está implicada en la supervivencia y la proliferación de timocitos (células T) durante una etapa temprana del desarrollo de las células T (Schluns K.S. et al., Nature Immunology, 2000, 1(5):426-432). Fry et al. también identificaron a la IL-7 como un potente modulador de la regeneración de células T independiente del timo en una acción multifactorial (Fry T.J. et al., Blood, 2001, 97(6): 1525-1533).

Por tanto, la IL-7 tiene un gran uso terapéutico potencial en la estimulación de la proliferación de precursores de células T, de células B que segregan anticuerpos, en la estimulación de la expansión periférica de células T dirigida por antígenos, y en la producción de células T sin estimular, así como otros tipos celulares hematopoyéticos. Un uso terapéutico particularmente interesante de moléculas de IL-7 activas es para la reconstitución inmunológica de pacientes linfopénicos: pacientes tratados de un cáncer, pacientes que hayan recibido una transferencia de médula ósea o de células pluripotenciales, pacientes que presentan una deficiencia inmunológica adquirida o genética, pacientes anciandos o cualquier paciente que tenga un recuento bajo de CD4. Otros intereses residen en la capacidad de IL-7 para producir nuevas células T CD4 sin estimular o para expandir agrupaciones específicas para producir o aumentar respuestas inmunológicas específicas (potenciación de vacunas).

A la vista de su potencial terapéutico, existe un considerable interés en desarrollar tecnologías para producir polipéptidos de IL-7 biológicamente activos y las correspondientes sustancias fármaco. Hay mucho interés en producir sustancias fármaco de IL-7 o composiciones farmacéuticas que cumplan con los requerimientos de las autoridades reguladoras y que sean adecuadas para unos usos terapéuticos eficaces.

Una sustancia fármaco o una composición farmacéutica dirigida a estimular una reconstitución inmunológica global o específica debe ser eficaz a largo plazo, lo cual implica que no debe desencadenar una reacción inmunológica específica contra su propio principio activo.

La presente invención ahora demuestra, de modo inesperado, que la actividad a largo plazo de una IL-7 humana recombinante es expresada principalmente por un confórmero 1-4: 2-5; 3-6 específico. La presente invención demuestra además que las sustancias fármaco eficaces no sólo deberían contener el anterior confórmero como constituyente principal, sino que también deberían estar exentas sustancialmente de otros confórmeros o variantes moleculares de IL-7, considerados previamente como productos activos.

Hasta la presente invención, aunque la existencia del confórmero Cys: 1-4; 2-5; 3-6 se había planteado como hipótesis a través de la formación de modelos por ordenador basándose en una analogía de conformación de GM-CSF o IL-4 hipotética, sólo se ha caracterizado el confórmero de IL-7 que muestra puentes disulfuro Cys: 1-6; 2-5; 3-4 mediante digestión tríptica y espectrometría de masas. Se creía que esta forma constituía la forma principal de IL-7. Por contraste absoluto con esto, la invención ahora propone nuevos productos polipeptídicos y composiciones farmacéuticas que están fundamentalmente exentas de dicho confórmero. La invención también describe métodos de producción y purificación ventajosos para producir dichos polipéptidos y composiciones, que muestran una alta actividad biológica con un riesgo reducido de respuestas no deseadas, tales como respuestas inmunológicas anti-IL-7.

Por tanto, la presente invención describe métodos mejorados para la preparación y el uso de dicho confórmero purificado de la IL-7 humana, exento de las impurezas o de las sustancias relacionadas con el producto mencionadas anteriormente, que muestra una actividad in vivo a largo plazo particularmente ventajosa, capaz de favorecer respuestas inmunológicas globales o específicas.

Sumario de la invención

Se describe un confórmero de IL-7 purificado, comprendiendo dicho confórmero de IL-7 los siguientes tres puentes disulfuro: Cys: 1-4 (Cys2-Cys92); 2-5 (Cys34-Cys129); 3-6 (Cys47-Cys141). Tal como se describe más a fondo a continuación, el confórmero de IL-7 es preferiblemente un confórmero de IL-7 recombinante humano, y puede estar glicosilado o no glicosilado.

También se describe una sustancia fármaco que comprende un confórmero de IL-7 según se describió anteriormente y que está fundamentalmente exenta de impurezas relacionadas con el producto y de sustancias relacionadas con el producto, en particular de otros confórmeros o dímeros de IL-7.

También se describe el uso de una sustancia fármaco según se describió anteriormente, para la fabricación de un medicamento ("producto de fármaco") o una composición farmacéutica.

También se describe una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de una sustancia fármaco según se describió anteriormente, y uno o más vehículos o excipientes farmacéuticamente compatibles.

También se describen moléculas de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de IL-7. Las moléculas de ácidos nucleicos comprenden una secuencia que codifica un polipéptido de IL-7, estando dicha secuencia optimizada para la expresión, en un hospedante recombinante, de IL-7 biológicamente activa, en particular de un confórmero de IL-7 según la invención. De modo más concreto, las moléculas de ácidos nucleicos proporcionan una expresión limitada de polipéptidos de IL-7 truncados y aumentan los rendimientos de producción del confórmero de IL-7 humano...

1. Una composición farmacéutica que comprende IL-7 y uno o más vehículos, excipientes o diluyentes farmacéuticamente compatibles o aceptables, en la que al menos 98% en peso de la cantidad total de IL-7 en la composición consiste en un confórmero de IL-7 que comprende los siguientes tres puentes disulfuro: Cys: 1-4 (Cys2-Cys92); 2-5 (Cys34-Cys129); y 3-6 (Cys47-Cys141).

2. La composición según la reivindicación 1, en la que dicho confórmero de IL-7 es un confórmero de IL-7 humano recombinante.

3. La composición según la reivindicación 2, en la que dicho confórmero de IL-7 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2 ó 4.

4. La composición según la reivindicación 1, en la que dicho confórmero de IL-7 es un confórmero de IL-7 de simio recombinante.

5. La composición según la reivindicación 4, en la que dicho confórmero de IL-7 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:12.

6. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicho confórmero de IL-7 no está glicosilado.

7. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicho confórmero de IL-7 está glicosilado.

8. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que dicho confórmero de IL-7 está asociado con el factor del crecimiento de hepatocitos como un heterodímero.

9. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que dicho confórmero de IL-7 está unido funcionalmente a una porción Fc de una cadena pesada de IgG a través de una región bisagra peptídica, siendo dicha IgG una IgG1 o IgG4 humanas.

10. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que dicho confórmero de IL-7 está asociado funcionalmente a la albúmina de suero humana (HSA) o a una porción de HSA como una proteína de fusión.

11. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que está exenta de cualquier otro confórmero de IL-7.

12. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que la cantidad total en peso de dicho confórmero de IL-7 es al menos 99,5% en peso de la cantidad total de IL-7 en la composición.

13. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que comprende un vehículo farmacéuticamente compatible seleccionado de sacarosa, trehalosa y un aminoácido.

14. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, que comprende un vehículo farmacéuticamente compatible contenido en un tampón apropiado para formar una disolución isotónica.

15. La composición de la reivindicación 14, en la que dicho tampón apropiado tiene un intervalo de pH comprendido entre 5 y 7,5, preferiblemente de 6 a 7, aún más preferiblemente de 6,5.

16. La composición de la reivindicación 15, en la que dicho tampón apropiado es una sal orgánica seleccionada de un tampón citrato de sodio y un tampón acetato de amonio.

17. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en la que dicha composición es una forma liofilizada.

18. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en la que dicha composición comprende una proteína (preferiblemente albúmina de suero humana) y/o un tensioactivo (preferiblemente Tween 80).

19. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 18, que comprende además un agente inmunoestimulante seleccionado de un factor del crecimiento de células hematopoyéticas, una citoquina, un antígeno y un adyuvante, o sus combinaciones, para un uso combinado, separado o secuencial.

20. La composición de la reivindicación 19, en la que dicho factor del crecimiento de células hematopoyéticas se selecciona del factor de células pluripotenciales (SCF), en particular la forma soluble del SCF, G-CSF, GM-CSF, ligando de Flt-3, IL-15 e IL-2.

21. La composición de la reivindicación 19, en la que la citoquina se selecciona de γ-interferón, IL-2, IL-12, RANTES, B7-1, MIP-2 y MIP-1α.

22. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, en la que dicho antígeno se selecciona de un péptido natural o sintético, una proteína recombinante, un producto de patógeno muerto, inactivado o atenuado, un lípido, sus porciones y sus combinaciones.

23. La composición de la reivindicación 22, en la que dicho antígeno se selecciona de antígenos derivados de VIH, virus de la varicela zoster, virus de la gripe, virus de Epstein-Barr, virus del herpes simplex de tipo 1 ó 2, citomegalovirus humano, virus del dengue, virus de la hepatitis A, B, C o E, virus respiratorio sincitial, virus del papiloma humano, Mycobacterium tuberculosis, toxoplasma y clamidia.

24. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 23, en la que dicho adyuvante se selecciona de cualquier sustancia, mezcla, soluto o composición que facilite o aumente la inmunogenicidad de un antígeno y que sea capaz de inducir una respuesta inmunológica de tipo Th1, tal como CpG, QS21, ISCOM y monofosforil-lípido A.

25. Una composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, para la administración a un paciente humano para la estimulación profiláctica o terapéutica del desarrollo y la proliferación de linfocitos B o T, o para la potenciación de una inmunorreconstitución global o específica, o para la potenciación de una respuesta inmunológica humoral o celular.

26. Una composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, para prevenir o reducir las infecciones oportunistas en pacientes inmunodeficientes.

27. Una composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, para prolongar la estimulación de la linfopoyesis y/o para producir una respuesta inmunológica específica y/o para ampliar el repertorio de una respuesta inmunológica específica en pacientes humanos.

28. Una composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 25, 26 ó 27, para su uso en pacientes humanos que son pacientes inmunodeficientes, pacientes con cáncer, pacientes que tienen injertos, pacientes infectados con un virus o un parásito, pacientes ancianos o cualquier paciente que tenga un recuento bajo de CD4.

29. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28, para su uso a una cantidad eficaz de IL-7 comprendida entre aproximadamente 3 y 300 μg/kg/día, preferiblemente entre 10 y 100 μg/kg/día, y en particular administrada de una vez diaria a dos o tres veces semanales, hasta una vez semanal.

30. Un método para producir una composición farmacéutica según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, comprendiendo dicho método:

a) proporcionar una muestra que comprende polipéptidos de IL-7,

b) purificar un confórmero de IL-7 que comprende los siguientes tres puentes disulfuro: Cys: 1-4 (Cys2-Cys92); 2-5 (Cys34-Cys129); y 3-6 (Cys47-Cys141), para producir una sustancia fármaco de IL-7, y

c) opcionalmente medir o cuantificar, en la sustancia fármaco, dicho confórmero de IL-7 particular.

31. El método de la reivindicación 30, en el que dicha muestra se obtiene a partir de células hospedantes procariotas o eucariotas recombinantes que producen polipéptidos de IL-7.

32. El método de la reivindicación 31, en el que dicha muestra es (o se deriva de) un cultivo de células hospedantes procariotas que codifican un polipéptido de IL-7, y además en el que dicho método comprende también, antes de la etapa b):

i) tratar dicha muestra para provocar la desnaturalización completa de dichos polipéptidos de IL-7,

ii) opcionalmente purificar el polipéptido desnaturalizado obtenido en la etapa i), y

iii) volver a plegar los polipéptidos.

33. El método de la reivindicación 32, en el que la etapa i) comprende la disolución de los cuerpos de inclusión en un tampón desnaturalizante.

34. El método de la reivindicación 32 ó 33, en el que la etapa ii) se realiza mediante cromatografía hidrófoba, cromatografía de intercambio iónico o en fase inversa.

35. El método de la reivindicación 33, en el que dicha cromatografía hidrófoba se aplica utilizando HIC butilo.

36. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 32 a 35, en el que la etapa ii) se realiza a un pH comprendido entre 6 y 9, preferiblemente entre 7 y 8,5, ambos inclusive.

37. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 32 a 36, en el que dicha etapa de purificación b) comprende realizar una cromatografía de afinidad.

38. El método de la reivindicación 37, en el que dicha cromatografía de afinidad se realiza en una columna de polisacáridos sulfatados.

39. El método de la reivindicación 38, en el que el polisacárido sulfatado es sulfato de dextrano o heparina.

40. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 30 a 39, en el que el confórmero de IL-7 se caracteriza en la sustancia fármaco mediante espectrometría de masas, espectroscopía de infrarrojos, RMN, mediante la determinación del dicroismo circular, mediante la medición de la afinidad hacia un anticuerpo monoclonal específico generado contra dicho confórmero de IL-7, o cromatografía de afinidad de heparina, y se mide o cuantifica mediante ELISA, bioensayo, o la afinidad de dicho confórmero de IL-7 por el receptor de IL-7 y cualquier método de cuantificación de proteínas si se aplica al confórmero aislado.