Antígeno E1 soluble de rubeola y variantes de este péptido, caracterizado porque:

(i) no presenta en el extremo C-terminal por lo menos la región transmembranal y el segmento de anclaje, así como por lo menos los aminoácidos 143 a 168, e (ii) contiene por lo menos la región que comprende los puentes disulfuro Cys349-Cys35 y Cys368-Cys401, y que comprende por lo menos los aminoácidos 315 a 412 de la secuencia de E1 de rubeola, en el que el antígeno E1 de rubeola se fusiona con una chaperona FKBP

Expresión recombinante de variantes de proteína de cubierta de rubeola E1 como proteínas de fusión chaperonas, y utilización de las mismas en la detección de anticuerpos anti-rubeola.

Campo de la invención

La invención se refiere a un antígeno soluble de la rubeola E1 y a variantes de este péptido caracterizados porque no presentan en el extremo C-terminal por lo menos la región transmembranal y el segmento de anclaje, así como por lo menos los aminoácidos 143 a 168 y que contiene por lo menos la región comprendida entre los puentes disulfuro Cys 349-Cys 352 y Cys 368-401 y que comprende por lo menos los aminoácidos 315 a 412 de la secuencia de rubeola E1, mientras que el antígeno de rubeola E1 se encuentra fusionado con una chaperona FKBP.

Antecedentes de la invención

El virus de la rubeola (RV) es un togavirus y el único representante del subgrupo Rubivirus. El virus, pequeño y con cubierta, presenta un tamaño de 65 nm y consiste de una única molécula de ARN de una cadena de 10 kb encapsulado en una nucleocápside icosahédrica que se encuentra circundada por una cubierta lipídica. El virus de la rubeola provoca una enfermedad infantil relativamente leve (sarampión alemán) que habitualmente resulta en inmunidad permanente que se cree que se encuentra mediada por tanto linfocitos T como anticuerpos. Las posibles consecuencias de las infecciones por rubeola en adultos son artritis transitoria/crónica, síndromes musculoesqueléticos, diabetes mellitus insulino-dependiente y aparición retardada de secuelas neurológicas.

El virus de la rubeola es un parámetro importante durante las primeras etapas del embarazo. La detección específica de IgM anti-rubeola y/o de IgG anti-rubeola, respectivamente, resulta crucial para la clarificación de si se ha producido una infección aguda o una reinfección activa.

La infección materna por virus de la rubeola durante el embarazo se asocia a riesgo de síndrome de rubeola congénita (CRS) en el feto, siendo más alta la incidencia de malformaciones congénitas cuando la infección primaria se produce en las primeras 12 semanas de la gestación. Por este motivo, la prevención de anormalidades congénitas causadas por la infección por RV durante el embarazo temprano requiere la determinación del estado inmunológico del individuo mediante serología, es decir una determinación selectiva de los anticuerpos IgG e IgM específicos para los antígenos del virus de la rubeola. La infección primaria por rubeola se asocia a una respuesta específica de anticuerpos IgM, mientras que los niveles elevados de IgG en ausencia de IgM detectable indica un estado inmunológico que es protector frente a la infección aguda por virus de la rubeola.

En el caso de que el cribado prenatal indique que la mujer ha adquirido una infección primaria por rubeola durante las etapas iniciales del embarazo, con frecuencia se recomienda un aborto terapéutico. En consecuencia, resulta imperativo que los resultados de la prueba sean exactos.

Para detectar anticuerpos contra RV, el diagnóstico rutinario de laboratorio se basa principalmente en los ensayos ELISA (ensayo de inmunosorción ligada a enzima), mientras que el método más ampliamente aceptado para determinar el estado inmunológico del RV en Europa central es la prueba de inhibición de la hemoaglutinación (HAI) para verificar el ensayo ELISA de Ig del RV (Weber, 1997).

La detección de anticuerpos específicos de una determinada clase de inmunoglobulina puede llevarse a cabo uniendo la inmunoglobulina a una fase sólida en la que se ha inmovilizado antígeno específico. La inmunoglobulina unida posteriormente se detecta con un anticuerpo marcado específico para inmunoglobulinas humanas de una clase determinada. Este formato de ensayo únicamente puede llevarse a cabo mediante un formato de ensayo de dos etapas, incluyendo una etapa de lavado para eliminar las inmunoglobulinas no unidas antes de la detección. Un formato de ensayo de una etapa con frecuencia realizado en analizadores automáticos de inmunoensayo requiere el formato de ensayo directo de un sándwich de doble antígeno, es decir, el anticuerpo específico forma un complejo inmunológico que se une a un primer antígeno que se inmoviliza en una fase sólida o que media en la inmovilización en una fase sólida, y un segundo antígeno que porta un marcaje, permitiendo de esta manera la detección cuantitativa o cualitativa del anticuerpo unido específicamente.

La determinación selectiva de anticuerpos IgG específicos en presencia de anticuerpos IgM de la misma especificidad en un formato sándwich de doble antígeno en una etapa requiere estrictamente la utilización de antígenos solubles monoméricos u oligoméricos definidos (patente EP nº 0 944 838), revelando conformaciones inmunorreactivas.

El virus de la rubeola incluye cuatro proteínas estructurales que se ha demostrado que son antigénicas en animales y en seres humanos. Existen tres glucoproteínas de cubierta: E1 (58 kDa), E2a (47 kDa) y E2b (42 kDa) y la proteína de cápside (C) no glucosilada (33 kDa) que decora la cadena positiva de ARN monocatenario que forma el genoma vírico (Waxham y Wolinsky, 1985a; Oker-Blom et al., 1984).

Se ha demostrado que E2a y E2b son variantes del mismo producto génico y la diferencia de migración en geles de poliacrilamida se debe a la glucosilación heterogénea de las proteínas. Se ha encontrado que E1 y E2 forman monómeros o complejos unidos por disulfuro (E1-E1 y E1-E2), mientras que C existe exclusivamente como homodímero (Waxham y Wolinsky, 1983; Wolinsky, 1996). Una revisión extensa de las propiedades biológicas, físicas y bioquímicas del RV, así como de las características clínicas de la infección ha sido publicada por Wolinsky (1996).

En la actualidad, se utilizan antígenos para la detección de una infección por rubeola, que se derivan de líneas celulares establemente infectadas/transfectadas y, en general, se originan en la sobreproducción eucariótica. Seppänen et al. (1991) describe la expresión de E1 y E2 del virus de la rubeola en células de insecto Sf9 de Spodoptera frugiperda mediante la utilización de un sistema de expresión baculovírico. Asimismo, Seto (1994) da conocer la expresión de E1 soluble en un sistema baculovírico. Además, se da a conocer en Hobman et al. (1994) una línea celular CHO establemente transfectada que expresa y secreta las proteínas estructurales E1, E2 y C del RV en forma de partículas de tipo RV (RLPs).

Las partículas de tipo rubeola están compuestas de los antígenos principales de la rubeola E1, E2 y C, que se expresan en forma de proteínas precursoras de polipéptidos víricos. Debido a secuencias de señal, estas proteínas precursoras no procesadas se secretan al medio y se forman partículas de tipo vírico. La superficie de estas RLPs presenta epítopos adecuados para la detección inmunológica de anticuerpo anti-RV en los sueros positivos para rubeola. La expresión de partículas de tipo RV no infecciosas (VLPs) que contienen las tres proteínas estructurales del RV en la línea celular BHK (células renales de hámster nenonato) se describe de manera general en Qui et al., 1994.

Sin embargo, la producción de antígenos del RV en sistemas celulares eucarióticos es laboriosa y requiere mucho tiempo, y el rendimiento es comparativamente reducido. El establecimiento de métodos diagnósticos in vitro de detección de anticuerpos anti-virus rubeola requiere procedimientos de producción de antígenos recombinantes del RV procedentes de organismos procarióticos como E. coli de calidad definida, soluble, funcional y reproducible, con claras ventajas respecto a las RLPs establecidas.

Aunque se está avanzando rápidamente en la materia del diseño y manipulación de proteínas, los antígenos de la rubeola E1, E2 y C se expresan con una abundancia muy reducida en las células huésped de E. coli y, además, presentan una solubilidad reducida.

El antígeno de rubeola inmunodominante, es decir, el antígeno de elección para la detección inmunológica de anticuerpos en sueros humanos, es la proteína de cubierta E1. La topología global de la proteína E1 comprende un gran ectodominio extracelular (1 a 452) que incluye una región α-helicoidal (438 a 452) con un dominio transmembranal (453 a 468), seguido de un segmento corto de anclaje C-terminal (hasta 481).

Un motivo de la insolubilidad de E1 del RV podría ser la conformación del ectodominio, que se supone que está estabilizado... [Seguir leyendo]

1. Antígeno E1 soluble de rubeola y variantes de este péptido, caracterizado porque: (i) no presenta en el extremo C-terminal por lo menos la región transmembranal y el segmento de anclaje, así como por lo menos los aminoácidos 143 a 168, e (ii) contiene por lo menos la región que comprende los puentes disulfuro Cys349-Cys35 y Cys368-Cys401, y que comprende por lo menos los aminoácidos 315 a 412 de la secuencia de E1 de rubeola, en el que el antígeno E1 de rubeola se fusiona con una chaperona FKBP.

2. Antígeno E1 soluble de rubeola según la reivindicación 1, caracterizado porque presenta adicionalmente en el extremo C-terminal, la región α-helicoidal entre los residuos aminoácidos 438 y 452.

3. Antígeno E1 soluble de rubeola según las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque la región N-terminal que contiene por lo menos la región que comprende los puentes disulfuro Cys8-Cys13 y Cys59-Cys71.

4. Antígeno E1 soluble de rubeola según la reivindicación 3, caracterizado porque contiene adicionalmente por lo menos la región que comprende el puente disulfuro Cys117-Cys130.

5. Antígeno E1 soluble de rubeola según las reivindicaciones 4 y 5, caracterizado porque contiene adicionalmente por lo menos la región que comprende el puente disulfuro Cys225-Cys235.

6. Antígeno E1 soluble de rubeola según las reivindicaciones 4 y 5, caracterizado porque contiene adicionalmente por lo menos la región que comprende el puente disulfuro Cys176-Cys185.

7. Antígeno E1 soluble de rubeola según las reivindicaciones 1 a 6, en el que la proteína se produce en forma de una proteína de fusión recombinante.

8. Molécula de ADN recombinante, codificante de un antígeno E1 de rubeola, que comprende por lo menos una secuencia de nucleótidos codificante de un antígeno E1 de rubeola según las reivindicaciones 1 a 6, en la que cadena arriba de la misma se encuentra por lo menos una secuencia de nucleótidos codificante de una chaperona FKBP.

9. Molécula de ADN recombinante según la reivindicación 8, caracterizada porque la chaperona FKBP se selecciona de entre el grupo que consiste de FkpA, SlyD y factor trigger.

10. Molécula de ADN recombinante según las reivindicaciones 8 y 9, caracterizada además porque comprende por lo menos una secuencia de nucleótidos codificante de un línker peptídico de 10 a 100 aminoácidos situado entre dicha secuencia codificante de un antígeno E1 de rubeola y dicha secuencia codificante de la chaperona FKBP.

11. Molécula de ADN recombinante según las reivindicaciones 8 a 10, caracterizada además porque por lo menos dos secuencias codificantes de una chaperona FKBP se encuentran situadas cadena arriba de la secuencia codificante de un antígeno E de rubeola.

12. Molécula de ADN recombinante según la reivindicación 11, caracterizada además porque una secuencia codificante de una chaperona FKBP se encuentra situada cadena arriba de un antígeno E de rubeola y la otra secuencia codificante de una chaperona FKBP se encuentra situada cadena abajo de la secuencia codificante de un antígeno E1 de rubeola.

13. Molécula de ADN recombinante según las reivindicaciones 11 y 12, caracterizada además porque comprende dos secuencias de ácidos nucleicos codificantes de un polipéptido línker de 10 a 100 aminoácidos.

14. Molécula de ADN recombinante según la reivindicación 13, en la que las dos secuencias de ácidos nucleicos codificantes de un línker de 10 a 100 aminoácidos son diferentes.

15. Vector de expresión que comprende operablemente ligada una molécula de ADN recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 14.

16. Célula huésped transformada con un vector de expresión según la reivindicación 15.

17. Método para producir una proteína de fusión soluble e inmunorreactiva de antígeno E1 de rubeola-chaperona FKBP, comprendiendo dicho método las etapas de: