EQUIPO Y MÉTODO DE AISLAMIENTO DE ÁCIDO NUCLEICO.

Un método independiente de pH para separar ácido nucleico de una muestra de ensayo que comprende:

(a) poner en contacto una muestra de ensayo con un material de soporte de óxido de metal con un tampón de enlace para formar complejos de ácido nucleico/material de soporte de óxido de metal, en el que el tampón de enlace comprende un agente caotrópico, un disolvente orgánico y un detergente y el punto de inflamación del tampón de enlace es mayor que 54,4 ºC (130 ºF); (b) separar los complejos de la muestra de ensayo; y (c) eluir el ácido nucleico del material de soporte de óxido de metal, en el que la etapa (a) permite que los ácidos nucleicos se empleen directamente en una reacción de multiplicación sin cambiar el tampón de elución.

Campo de la invención 5 La presente invención se refiere a métodos para aislar ácidos nucleicos y más particularmente se refiere a métodos para aislar ácidos nucleicos que no usan concentraciones importantes de componentes inflamables. Antecedentes de la invención 10 Se conocen bien varios métodos para aislar ácidos nucleicos a partir de varias fuentes. Los primeros métodos empleaban disolventes orgánicos, tales como fenol y/o cloroformo, para precipitar de forma selectiva y posteriormente retirar las proteínas de una disolución que contiene ácidos nucleicos. Una vez que la proteína ha sido retirada, posteriormente se puede precipitar el ácido nucleico disuelto usando alcohol y se puede recoger sobre una 15 superficie sólida. Su usó posteriormente un tampón apropiado para disolver el ácido nucleico y de este modo retirarlo de la superficie sólida. Como se ha mencionado previamente, los primeros métodos para purificar secuencias de ácido nucleico típicamente empleaban disolventes orgánicos para precipitar de forma diferencial las secuencias de ácido nucleico a partir de las 20 proteínas y otra materia no deseada presente en el material de fuente. Una vez precipitado, el ácido nucleico se recoge de forma sencilla sobre un substrato sólido, tal como un rodillo de agitación de vidrio, antes de que se disuelva en estado puro. Desde el punto de vista de purificación de ácidos nucleicos, también se ha explotado la afinidad que el ácido nucleico muestra por los substratos sólidos en presencia de un agente caotrópico. Estos métodos de preparación de muestra además de emplear agentes caotrópicos típicamente usan disolventes 25 orgánicos, tales como un alcohol, con el fin de garantizar que el ácido nucleico se une al substratos sólido o permanece unido al substrato durante los procedimientos de lavado. Dichos procedimientos usan concentraciones relativamente bajas de disolventes orgánicos, en comparación con los primeros métodos de aislamiento de ácidos nucleicos en los que los disolventes orgánicos eran los únicos reactivos empleados, las concentraciones de alcohol usadas en estos procedimientos no obstante dan lugar a importantes problemas de eliminación y seguridad, 30 especialmente cuando se procesan elevados volúmenes de muestras. Con la llegada de las reacciones de multiplicación de ácidos nucleicos tales como, por ejemplo, la reacción de cadena de polimerasa (PCR), la reacción de cadena de ligasa (LCR) y otros procedimientos similares designados para sintetizar copias múltiples de una secuencia objetivo de ácido nucleico, el aislamiento de secuencias de ácido 35 nucleico a partir de materiales fuente (en ocasiones referidos como “preparación de muestra”) se ha convertido en un área de investigación cada vez más importante. Varias consideraciones, fuera de la mera purificación de secuencias de ácido nucleico, hacen que el descubrimiento de métodos de preparación útiles constituya un reto. Por ejemplo, la contaminación de muestra a muestra con ácidos nucleicos extraños es una preocupación importante y bien documentada. De manera adicional, las muestras iniciales que contienen la secuencia deseada de ácido 40 nucleico (o “secuencia objetivo de ácido nucleico”), con frecuencia también contiene concentraciones muy pequeñas de la secuencia objetivo, así como concentraciones comparativamente grandes de ácidos nucleicos extraños. Además, muchas veces la preparación de muestra se lleva a cabo en zonas altamente reguladas, en términos de reactivos que se pueden usar y desechar finalmente. Además, en los casos en los que se purifica el ácido nucleico con el fin de ser usado en una reacción de multiplicación, es importante para el ácido nucleico residir de forma final 45 en un tampón que no comprenda componentes que inhiban las enzimas comúnmente usadas en las reacciones de multiplicación. Asimismo, es preciso tener en cuenta varias consideraciones, más allá de la mera purificación de las secuencias de ácido nucleico, por lo que respecta al diseño de un método útil de preparación de muestra. En el documento de EE.UU. 5.973.138 se divulga un método para unir de forma reversible partículas para-50 magnéticas, en una disolución ácida, a moléculas de ácido nucleico. El método resulta útil para purificar y manipular ácidos nucleicos. En el documento de EP-A-0818461 se divulga un método para aislar ARN que comprende las etapas de: mezclar la muestra que contiene ARN con un vehículo de unión a ácido nucleico, tal como un óxido de metal super-magnético y 55 una disolución ácida que contiene una sal de litio y un agente caotrópico, para adsorber el ARN sobre el vehículo; separar el vehículo unido a ARN de la fase líquida; y eluir el ARN del vehículo unido a ácido nucleico. El documento DE 19520398 A divulga una partícula magnética con una superficie externa vítrea que es no porosa o que presenta poros con un diámetro menor que 10 nm y una partículas ferro-magnética con una superficie vítrea. 60 Las partículas son útiles para aislar materiales biológicos, tales como ácidos nucleicos.

En el documento WO 91/12079 se divulga un método para tratar una disolución de un polímero con bolitas susceptibles de atracción magnética que no se unen de forma específica al polímero. El método comprende suspender las bolitas en la disolución; precipitar el polímero de la disolución, donde se asocia de forma no específica 65 con las bolitas; aplicar un campo magnético para dar lugar a un precipitado de bolitas y polímero asociado; y separar

el precipitado del líquido sobrenadante. El documento WO 92/18514 divulga un método para la purificación de ácidos nucleicos a partir de una muestra que usa un soporte de óxido de metal capaz de forzar la sorción de al menos un tipo de ácido nucleico a partir de la disolución. 5 En el documento EP-A-0391608 se divulgan una composición que comprende un soporte con una cantidad de óxido de metal suficiente para provocar la sorción de ácido nucleicos y el ácido nucleico que ha experimentado sorción sobre parte de la superficie disponible del soporte. El ácido nucleico ha experimentado sorción de forma tal que se le permite mantener considerablemente su accesibilidad biológica y reactividad. 10 De esta forma, es necesario un método de preparación de muestra que proporcione un aislamiento cuantitativo de ácidos nucleicos, con una manipulación mínima y que no precise del uso de disolventes orgánicos inflamables. Sumario de la invención 15 La presente invención proporciona un método independiente del pH para separar ácidos nucleicos de una muestra de ensayo que comprende:

(a) poner en contacto una muestra de ensayo con un material de soporte de óxido de metal con un tampón 20 de enlace para formar complejos de material de soporte de óxido de metal/ácido nucleico, en los que el tampón de enlace comprende un agente caotrópico, un disolvente orgánico y un detergente y el punto de inflamación del tampón de enlace es mayor que 54,4 ºC (130º F);

(b) separar los complejos de la muestra de ensayo; y

(c) eluir el ácido nucleico del material de soporte de óxido de metal, 25

en el que la etapa (a) permite que los ácidos nucleicos se empleen de manera directa en la reacción de multiplicación sin intercambiar un tampón de elución. El método es suficientemente robusto como para poder purificar ácidos nucleicos a partir de distintas fuentes que 30 contienen ácido nucleico tales como bacterias y virus como los que pueden detectarse últimamente. Breve descripción de los dibujos La Figura 1 y la Figura 2 representan un análisis por ordenador de los datos obtenidos en el Ejemplo comparativo 5. 35 Descripción detallada de la invención Los métodos que se proporcionan en el presente documento emplean un material de soporte de óxido de metal para separar ácidos nucleicos de otros, pero no necesariamente todos, componentes que se encuentran en la muestra de 40 ensayo. De manera específica, se emplea el óxido de metal para purificar el ácido nucleico de otros componentes de la muestra de ensayo. Se ha descubierto que el uso de materiales de soporte de óxido de metal, como los que se muestran en el presente documento, proporciona importantes ventajas con respecto a los métodos de preparación de muestra disponibles comercialmente. Por ejemplo, los óxidos de metal presentan una elevada afinidad por las secuencias de ácido nucleico y por tanto la contaminación muestra a muestra queda minimizada, ya que el ácido 45 nucleico se puede unir de forma controlada al soporte de óxido de metal sin escapar a zonas no deseadas. De manera adicional, los soportes... [Seguir leyendo]

1. Un método independiente de pH para separar ácido nucleico de una muestra de ensayo que comprende:

(a) poner en contacto una muestra de ensayo con un material de soporte de óxido de metal con un tampón 5 de enlace para formar complejos de ácido nucleico/material de soporte de óxido de metal, en el que el tampón de enlace comprende un agente caotrópico, un disolvente orgánico y un detergente y el punto de inflamación del tampón de enlace es mayor que 54,4 ºC (130 ºF);

(b) separar los complejos de la muestra de ensayo; y

(c) eluir el ácido nucleico del material de soporte de óxido de metal, 10

en el que la etapa (a) permite que los ácidos nucleicos se empleen directamente en una reacción de multiplicación sin cambiar el tampón de elución. 2. El método de la reivindicación 1, en el que el tampón de enlace comprende además un agente reductor. 15 3. El método de la reivindicación 1, que además comprende una etapa de lavado después de la separación de los complejos de la muestra de ensayo y antes de eluir el ácido nucleico del material de soporte de óxido de metal. 4. El método de la reivindicación 1, en el que la elución del ácido nucleico del material de soporte de óxido de metal 20 comprende poner en contacto los complejos con un reactivo que se escoge entre agua o un tampón que contiene fosfato. 5. El método de la reivindicación 4, que además comprende la etapa de detectar el ácido nucleico después de eluir el ácido nucleico del material de soporte de óxido de metal. 25 6. El método de la reivindicación 5 que además comprende la etapa de multiplicar el ácido nucleico después de eluir el ácido nucleico del material de soporte de óxido de metal y antes de detectar el ácido nucleico. 7. El método de la reivindicación 5, en el que el ácido nucleico comprende un ácido nucleico procedente de distintas 30 fuentes. 8. El método de la reivindicación 7, en el que el ácido nucleico es ARN y ADN.

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