ENZIMAS HÍBRIDAS QUE CONSISTEN EN UNA PRIMERA SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS DE ENDOAMILASA Y UN MÓDULO DE UNIÓN DE CARBOHIDRATOS COMO SEGUNDA SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS.
Polipéptido el cual es un híbrido comprendiendo; a) una primera secuencia de aminoácidos teniendo actividad endo-amilasa y teniendo al menos un 60% de identidad con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO:
35 y b) una segunda secuencia de aminoácidos comprendiendo un módulo de unión a carbohidratos y teniendo al menos un 60% de identidad con la secuencia de aminoácidos mostrada como los residuos de aminoácidos del 485 al 586 en la SEC ID NO: 2, donde dicha primera secuencia de aminoácidos y/o dicha segunda secuencia de aminoácidos se deriva de una bacteria
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/DK2005/000819.
Solicitante: NOVOZYMES A/S.
Nacionalidad solicitante: Dinamarca.
Dirección: KROGSHOJVEJ 36 2880 BAGSVAERD DINAMARCA.
Inventor/es: SVENDSEN, ALLAN, SPENDLER, TINA, ANDERSEN, CARSTEN, VIKSOE-NIELSEN,ANDERS, ØSTDAL,Henrik.
Fecha de Publicación: .
Fecha Solicitud PCT: 22 de Diciembre de 2005.
Clasificación PCT:
- A21D8/04 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A21 COCCION EN HORNO; EQUIPAMIENTO PARA LA PREPARACION O EL TRATAMIENTO DE LA MASA; MASAS PARA COCER EN HORNO. › A21D TRATAMIENTO, p.ej. CONSERVACION DE LA HARINA O DE LA MASA, p.ej. POR ADICION DE INGREDIENTES; COCCION; PRODUCTOS DE PANADERIA; SU CONSERVACION. › A21D 8/00 Métodos de preparación o de cocción de la masa (tratamiento de la harina o de la masa por adición de ingredientes A21D 2/00). › tratando la masa con microorganismos o enzimas.
- C07K19/00 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › Péptidos híbridos (Inmoglobulinas híbridas compuestas solamente de inmoglobulinas C07K 16/46).
- C12N1/14 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 1/00 Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo. › Microorganismos fúngicos (cultivo de setas A01G 18/00; como novedades vegetales A01H 15/00 ); Sus medios de cultivo.
- C12N1/20 C12N 1/00 […] › Bacterias; Sus medios de cultivo.
- C12N15/56 C12N […] › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › que actúan sobre compuestos glicosílicos (3.2), p. ej. amilasa, galactosidasa, lisozima.
- C12N5/10 C12N […] › C12N 5/00 Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00). › Células modificadas por introducción de material genético extraño, p. ej. células transformadas por virus.
- C12N9/28 C12N […] › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › alfa-amilasa de origen microbiano, p. ej. amilasa bacteriana.
Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania, Letonia.
PDF original: ES-2356703_T3.pdf
Fragmento de la descripción:
Enzimas híbridas que consisten en una primera secuencia de aminoácidos de endoamilasa y un módulo de unión de carbohidratos como segunda secuencia de aminoácidos.
Campo de la invención
La presente invención se refiere, entre otras cosas, a enzimas híbridas comprendiendo un módulo de unión a carbohidratos y teniendo actividad endo-amilasa. Las enzimas se pueden utilizar en procesos comprendiendo la modificación y/o degradación de almidón, o en procesos de producción de puré.
Antecedentes de la invención
Se usan endo-amilasas bacterianas en un gran número de procesos, por ejemplo, para la licuefacción de almidón en procesos donde se modifica, y/o degrada almidón a polímeros más pequeños o monómeros de glucosa. Los productos de degradación pueden usarse en la industria, por ejemplo, como maltosa y/o jarabes de fructosa o además procesarse en un paso de fermentación a un producto de fermentación, por ejemplo, etanol. Las endo-amilasas bacterianas se usan en la cocción para dar blandura adicional y una mejor humedad de la miga de pan. No obstante, es fácil sobredosificar las endo-amilasas, lo cual puede resultar en una gomosidad y una pérdida indeseable de elasticidad en el producto horneado. Existe una necesidad de endo-amilasas con propiedades para el uso mejoradas en varios procesos, por ejemplo, dentro del tratamiento y de la cocción de almidón.
Resumen de la invención
Los presentes inventores han descubierto ahora sorprendentemente que añadiendo un módulo de unión a carbohidratos (CBM) a una endo-amilasa se puede modificar la actividad catalítica de la endo-amilasa dando así como resultado un rendimiento de cocción aumentado en comparación con la enzima de tipo salvaje. No hay ningún cambio significante en el sabor o el olor del producto horneado. Sin atarse a la teoría se sugiere que el efecto se debe a una actividad aumentada hacia el almidón crudo en la masa conferida por el CBM, y/o una actividad reducida hacia el almidón calentado en el pan de cocción conferida por el CBM. La endo-amilasa con un CBM se puede usar como una enzima de cocción con menos riesgo de sobredosificación en comparación con la enzima sin un CBM. Tales híbridos que consisten en un polipéptido teniendo actividad endo-amilasa y un módulo de unión a carbohidratos, principalmente teniendo afinidad con el almidón como por ejemplo con el CBM20, tiene la ventaja sobre las endo-amilasas existentes que seleccionando un dominio catalítico con propiedades deseadas como por ejemplo el perfil de pH, el perfil de temperatura, la resistencia a la oxidación, la estabilidad del calcio, la afinidad del sustrato o el perfil del producto se puede combinar con un módulo de unión a carbohidratos con afinidades de enlace más débiles o más fuertes, por ejemplo, afinidades específicas con la amilosa, afinidades específicas con la amilopectina o afinidades con la estructura específica en el carbohidrato. El híbrido se puede utilizar como un aditivo de cocción, por ejemplo, como una enzima anti-endurecimiento.
Los presentes inventores también han descubierto sorprendentemente que añadiendo un módulo de unión a carbohidratos (CBM) a una endo-amilasa la actividad y la especificidad se pueden alterar aumentando así la eficacia de diferentes procesos de degradación de almidón, por ejemplo, comprendiendo la degradación de la sustancia cruda, por ejemplo, almidón no gelatinizado al igual que almidón gelatinizado. Debido a la actividad de hidrólisis superior de estas endo-amilasas teniendo un CBM el proceso de conversión de almidón global se puede realizar sin tener que gelatinizar el almidón, es decir las endo-amilasas teniendo un CBM hidrolizan almidón granulado en un proceso de almidón crudo al igual que almidón completamente o parcialmente gelatinizado en un proceso de almidón tradicional.
Por consiguiente la invención proporciona en un primer aspecto un polipéptido que es un híbrido comprendiendo; una primera secuencia de aminoácidos teniendo actividad endo-amilasa y teniendo al menos un 60% de identidad con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 35 y una segunda secuencia de aminoácidos comprendiendo un módulo de unión a carbohidratos y teniendo al menos un 60% de identidad con la secuencia de aminoácidos mostrada como los residuos de aminoácidos 485 a 586 en la SEC ID NO: 2, donde dicha primera secuencia de aminoácidos y/o dicho segundo amino se deriva de una bacteria.
La invención proporciona además un proceso preparando una masa o un producto comestible hecho de una masa, comprendiendo el proceso añadir el polipéptido del primer aspecto a la masa.
La invención proporciona además un proceso comprendiendo; (a) poner en contacto un almidón con un polipéptido según el primer aspecto, (b) incubar dicho almidón con dicho polipéptido durante un tiempo y a una temperatura suficiente para conseguir la conversión de al menos el 90% p/p de dicho sustrato de almidón en azúcares fermentables, (c) fermentar para producir un producto de fermentación, (d) opcionalmente recuperar el producto de fermentación.
La invención proporciona además un aditivo para mejorar el pan o la masa en forma de un granulado o polvo aglomerado comprendiendo el polipéptido del primer aspecto.
La invención proporciona además una secuencia de ADN codificando el polipéptido del primer aspecto.
La invención proporciona además un constructo de ADN comprendiendo la secuencia de ADN al igual que una célula huésped comprendiendo el constructo de ADN.
Descripción detallada de la invención
Enzimas híbridas
El polipéptido de la invención es una enzima híbrida comprendiendo una primera secuencia de aminoácidos teniendo actividad endo-amilasa, y una segunda secuencia de aminoácidos comprendiendo un módulo de unión a carbohidratos (CBM). El híbrido se puede producir por fusión de unas primeras secuencias de ADN codificando unas primeras secuencias de aminoácidos y unas segundas secuencias de ADN codificando unas segundas secuencias de aminoácidos, o el híbrido se puede producir como un gen completamente sintético basado en el conocimiento de las secuencias de aminoácidos de CBMs adecuados, enlazadores y dominios catalíticos.
El término "enzima híbrida" (también referido como, "proteína de fusión", "híbrido", "polipéptido híbrido" o "proteína híbrida") se usa aquí para caracterizar los polipéptidos de la invención comprendiendo una primera secuencia de aminoácidos comprendiendo al menos un módulo catalítico teniendo actividad endo-amilasa y una segunda secuencia de aminoácidos comprendiendo al menos un módulo de unión a carbohidratos donde la primera y la segunda están derivadas de distintas fuentes. El término "fuente" siendo entendido como por ejemplo, pero no limitado a, una enzima parental, o una variante de la misma, por ejemplo, una amilasa o glucoamilasa, u otra actividad catalítica comprendiendo un módulo catalítico adecuado y/o un CBM adecuado y/o un enlazador adecuado. No obstante el CBM también puede estar derivado de un polipéptido no teniendo ninguna actividad catalítica. La primera y la segunda secuencia de aminoácidos se pueden derivar de la misma cepa bacteriana, de cepas en las mismas especies, de especies estrechamente relacionadas u organismos menos relacionados. Preferiblemente la primera y la segunda secuencia de aminoácidos de los híbridos derivados de distintas fuentes, por ejemplo, de distintas enzimas de la misma cepa y/o especies, o por ejemplo, de cepas dentro de especies diferentes.
Los números de clasificación enzimáticos (números EC) referidos en la presente especificación están conforme a las Recomendaciones del Comité de Nomenclatura de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular (http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/).
Enzimas híbridas como las denominadas en este caso incluyen especies comprendiendo una secuencia de aminoácidos de una endo-amilasa, es decir una alfa-amilasa (EC 3.2.1.1) la cual se enlaza (es decir, mediante unión covalente) a una secuencia de aminoácidos comprendiendo un módulo de unión a carbohidratos (CBM). La enzima híbrida es así una enzima capaz de catalizar hidrólisis de almidón en una endo-forma.
Enzimas híbridas conteniendo CBM, al igual que descripciones detalladas de la preparación y purificación de las mismas, se conocen en la técnica [véase, por ejemplo, WO 90/00609, WO 94/24158 y WO 95/16782, al igual que Greenwood et al. Biotechnology and Bioengineering 44 (1994) págs. 1295-1305].... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Polipéptido el cual es un híbrido comprendiendo;
donde dicha primera secuencia de aminoácidos y/o dicha segunda secuencia de aminoácidos se deriva de una bacteria.
2. Polipéptido según la reivindicación 1, teniendo al menos un 60% de identidad, al menos un 70% de identidad, al menos un 80% de identidad, o incluso al menos un 90% de identidad con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 4.
3. Proceso para preparar una masa o un producto comestible hecho a partir de una masa, cuyo proceso comprende añadir el polipéptido según la reivindicación 1 a la masa.
4. Proceso según la reivindicación 3 comprendiendo además añadir una actividad de exo-amilasa, preferiblemente una actividad de alfa-amilasa maltogénica, preferiblemente Novamyl.
5. Proceso comprendiendo;
6. Aditivo de mejora de pan o de masa en forma de un granulado o polvo aglomerado comprendiendo el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2.
7. Secuencia de ADN codificando un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2.
8. Constructo de ADN comprendiendo la secuencia de ADN según la reivindicación 7.
9. Vector de expresión recombinante el cual porta el constructo de ADN según la reivindicación 8.
10. Célula huésped la cual se transforma con el constructo de ADN según la reivindicación 8 o el vector según la reivindicación 9.
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