ENZIMAS DE ÁCIDO NUCLEICO MULTICOMPONENTES Y PROCEDIMIENTOS PARA SU USO.

Enzimas de ácido nucleico multicomponentes y procedimientos para su uso. Referencia cruzada a solicitudes relacionadas La presente solicitud reivindica el beneficio de prioridad de las Solicitudes de Patente Provisionales de Estados Unidos Nº 60/726.291 presentada el 13 de octubre de 2005 y 60/724.567 presentada el 7 de octubre de 2005, respectivamente. Campo técnico La presente invención se refiere a ácidos nucleicos catalíticos multicomponentes y procedimientos para su uso. Más particularmente, la invención se refiere a composiciones que comprenden enzimas de ácido nucleico multicomponentes autoensamblables, procedimientos para preparar tales composiciones y procedimientos para usar tales composiciones, incluyendo para detectar, identificar y/o cuantificar dianas tales como facilitadores de ensamblaje y otras entidades detectando modificación catalítica de sustratos por dichas enzimas de ácido nucleico multicomponentes. Antecedentes de la invención Las moléculas de ácido nucleico pueden adoptar configuraciones estructurales secundarias que pueden conferir actividad catalítica o enzimática. La tecnología de evolución in vitro ha facilitado el descubrimiento y desarrollo de tales ácidos nucleicos catalíticos, con frecuencia denominados ADNzimas o ribozimas, que son capaces de catalizar una amplia serie de reacciones incluyendo escisión de ácidos nucleicos (Carmi y col., 1996; Raillard y Joyce, 1996; Breaker, 1997; Santoro y Joyce, 1998), ligación de ácidos nucleicos (Cuenoud y Szostak, 1995), metalación de porfirina (Li y Sen, 1996), y la formación de enlaces carbono-carbono (Tarasow y col., 1997), enlaces éster (Illangasekare y col., 1995) o enlaces amida (Lohse y Szostak, 1996). En particular, se han caracterizado ADNzimas y ribozimas que escinden específicamente secuencias de ácido nucleico definidas después de hibridar mediante formación de pares de bases de Watson Crick. Las ADNzimas son capaces de escindir moléculas de ARN (Breaker y Joyce, 1994; Santoro y Joyce, 1997) o ADN (Carmi y col., 1996). Las moléculas de ARN catalíticas (ribozimas) también son capaces de escindir secuencias tanto de ARN (Haseloff y Gerlach, 1988) como de ADN (Raillard y Joyce, 1996). La tasa de escisión catalítica de la mayoría de enzimas de ácido nucleico depende de la presencia y concentración de iones metálicos divalentes tales como Ba 2+ , Sr 2+ , Mg 2+ , Ca 2+ , Ni a+ , Co 2+ , Mn 2+ , Zn 2+ y Pb 2+ (Santoro, y Joyce, 1998; Brown y col., 2003). Los ácidos nucleicos catalíticos, tales como la ribozima cabeza de martillo y las ADNzimas 10:23 y 8:17, tienen múltiples dominios. Tienen un dominio catalítico conservado (núcleo catalítico) flanqueado por dos dominios de unión de sustrato no conservados (ramas de hibridación), que son regiones de secuencia que se unen específicamente al sustrato. Haseloff y Gerlach obtuvieron por ingeniería genética la ribozima cabeza de martillo, que se denominó así por la estructura en tallo de bucle que junta los dos dominios conservados formando el núcleo catalítico (Haseloff y Gerlach, 1988). Las ADNzimas 10:23 y 8:17 son capaces de escindir sustratos de ácido nucleico en enlaces fosfodiéster de ARN específicos (Santoro y Joyce, 1997). La ADNzima 10:23 tiene un dominio catalítico de 15 desoxinucleótidos flanqueados por dos ramas de reconocimiento de sustrato. La ADNzima 8:17 tiene un dominio catalítico de 14 desoxinucleótidos que también está flanqueado por dos ramas de reconocimiento de sustrato. Un ácido nucleico catalítico puede escindir un sustrato de ácido nucleico con una secuencia diana que cumple los requisitos mínimos. La secuencia sustrato debe ser sustancialmente complementaria a las ramas de hibridación del ácido nucleico catalítico y el sustrato debe contener una secuencia específica en el sitio de escisión. Los requisitos de la secuencia específica en el sitio de escisión incluyen, por ejemplo, una secuencia de ribonucleótido purina:pirimidina para escisión por la ADNzima 10:23 (Santoro y Joyce, 1997) y la secuencia uridina:X para las ribozimas cabeza de martillo (Perriman y col., 1992), en la que X puede equivaler a A, C, o U, pero no G. Se ha mostrado que los ácidos nucleicos catalíticos tuvieran solamente ciertas modificaciones en el área que forma el núcleo catalítico (Perreault y col., 1990; Perreault y col., 1991; Zaborowska y col., 2002; Cruz y col., 2004; Silverman, 2004)). Se enumeran ejemplos de secuencias responsables de actividad catalítica de ADNzimas en la Tabla 1. Tabla 1: Secuencias ejemplares para algunas ADNzimas activas y sus sustratos Tipo de ADNzima Secuencia de ADNzima Secuencia de sustrato 8:17 (N)xTNNNAGCNNNWCGK(N)x (N)x (rN)x G (N)x 10:23 (N)xGGMTMGHNDNNNMGD(N)x (N)x rR rY (N)x N = A, C, T, G o cualquier análogo; N = cualquier nucleótido complementario a N;(N)x o (N)x = cualquier número de nucleótidos; W = A o T; K = A, G o AA; rN = cualquier base ribonucleotídica;(rN)x = cualquier número de ribonucleótidos; rR = A o G; rY = C o U; M = A o C; H = A, C o T; D = G, A o T 2   La sustitución de ciertos desoxirribonucleótidos para ciertos ribonucleótidos en ribozimas conocidas se ha intentado en ciertas condiciones (McCall y col., 1992). Las ribozimas que se han convertido completamente a ADN no tienen actividad debido a las diferencias conformacionales de ARN y ADN (Perreault y col., 1990). Estos estudios demuestran que las enzimas de ARN no pueden modificarse en enzimas de ADN funcionales simplemente reemplazando los ribonucleótidos con desoxirribonucleótidos. Ha habido algunos estudios que han intentado desarrollar ciertas ribozimas homodiméricas o heterodiméricas para aplicaciones terapéuticas (Kuwabara y col., 1999; Kuwabara y col., 2000; Oshima y col., 2003). En estos estudios, el núcleo catalítico de la ribozima comprendía solamente ribonucleótidos. Además, la capacidad de las ADNzimas para actuar en formatos diméricos o multiméricos no se ha considerado, ni se ha proporcionado ninguna información sobre como extrapolar de una ribozima dimérica a una ADNzima dimérica en lo que respecta a una posible estructura de una ADNzima dimérica y actividad resultante. Se han usado ácidos nucleicos catalíticos en combinación con protocolos de amplificación in vitro como un medio para generar una señal detectable, permitiendo de este modo el control en tiempo real de secuencias diana de ácido nucleico amplificadas (Todd y col., 2000) (documentos US 6.140.055; US 6.201.113; WO 99/45146; PCT/IB99/00848; WO 99/50452). La detección de zimógeno (documentos US 6.140.055; US 6.201.113; WO 99/45146; PCT/IB99/00848; WO 99/50452), también conocido en la técnica como detección de DzyNA (Todd y col., 2000), da como resultado amplificación de señal y diana simultánea. Esto se produce debido a que las ADNzimas catalíticas o ribozimas se coamplifican junto con secuencias diana para producir amplicones que actúan como verdaderas enzimas capaces de renovación múltiple. Como tal, cada amplicón de ácido nucleico catalítico escinde múltiples sustratos indicadores. Las ADNzimas y ribozimas se introducen en los amplicones usando cebadores con marcadores 5 que están inactivos, secuencias antisentido de ácidos nucleicos catalíticos. Cuando estas secuencias se copian durante la amplificación in vitro las secuencias sentido catalíticamente activas se coamplifican junto con la secuencia diana. El enfoque de zimógeno/DzyNA es muy flexible puesto que la amplificación de señal catalítica puede ligarse a procedimientos de amplificación de diana incluyendo PCR (reacción en cadena de la polimerasa), amplificación de desplazamiento de cadena (SDA) o amplificación de círculo rodante (RCA), que producen amplicones de ADNzima; y procedimientos de amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos (NASBA), replicación de secuencia autosostenida (3SR) o amplificación mediada por transcripción (TMA) que producen amplicones de ribozima. Además, puesto que se han descubierto o han evolucionado numerosas moléculas de ácido nucleico catalítico con una amplia serie de actividades catalíticas, el enfoque de zimógeno puede usar un sustrato indicador distinto de un ácido nucleico en el que la lectura del ensayo depende de una modificación química distinta de escisión de un sustrato de ácido nucleico. El enfoque de zimógeno/DzyNA (Todd y col., 2000) o NASBA/ribozima (documento WO 00/58505) puede considerarse sensible y útil pero existe potencial de ruido debido a amplificación de secuencias de cebadores. Se ha usado NASBA para producir amplicones de ARN que contienen ácido nucleico diana y una sección del núcleo catalítico de la ribozima cabeza de martillo (GAArA), introducida como secuencia antisentido marcada con un cebador y después copiada (documento WO 00/58505). La secuencia adicional requerida para actividad catalítica (CUrGANrGrA) se introdujo como... [Seguir leyendo]

1. Una composición que comprende al menos dos o más componentes oligonucleotídicos en la que al menos un primer componente oligonucleotídico y un segundo componente oligonucleotídico se autoensamblan en presencia de un facilitador de ensamblaje de MNAzima para formar una enzima de ácido nucleico multicomponente (MNAzima) catalíticamente activa, en la que cada uno de dichos al menos primer y dicho segundo componentes oligonucleotídicos comprende una parte de rama se sustrato, una parte de núcleo catalítico y una parte de rama sensora; en la que tras el autoensamblaje, la parte de rama sensora de dichos primer y segundo componentes oligonucleotídicos actúan como ramas sensoras de la MNAzima, la parte de rama de sustrato del primer y segundo componentes oligonucleotídicos actúan como ramas de sustrato de la MNAzima, y el núcleo catalítico del primer y segundo componentes oligonucleotídicos actúa como un núcleo catalítico de la MNAzima; y en la que las ramas sensoras de la MNAzima interaccionan con dicho facilitador de ensamblaje de MNAzima para mantener el primer y segundo componentes oligonucleotídicos en proximidad para asociación de sus respectivas partes de núcleo catalítico para formar el núcleo catalítico de la MNAzima, siendo capaz dicho núcleo catalítico de modificar al menos un sustrato y en la que dichas ramas de sustrato de dicha MNAzima interaccionan con un sustrato de modo que dicho núcleo catalítico de dicha MNAzima puede modificar dicho sustrato. 2. La composición de la reivindicación 1 en la que al menos uno de dichos componentes oligonucleotídicos, facilitador de ensamblaje o sustrato están comprendidos por ADN o un análogo del mismo. 3. La composición de la reivindicación 1 o 2 en la que dicho facilitador de ensamblaje es una diana a identificar, detectar o cuantificar. 4. La composición de la reivindicación 3 en la que dicha diana es un ácido nucleico. 5. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende adicionalmente al menos un tercer componente oligonucleotídico que actúa para estabilizar al menos una de dichas partes de rama de sustrato o partes de rama sensora. 6. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 en la que al menos uno de dicho facilitador de ensamblaje, dichos componentes oligonucleotídicos o sustrato o una combinación de los mismos está comprendido por más de una molécula. 7. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que las partes de núcleo catalítico del primer componente oligonucleotídico se seleccionan del grupo que comprende SEC ID Nº: 149 - 153, 155 - 157, 159 y 161 y las partes del núcleo catalítico del segundo componente oligonucleotídico se seleccionan del grupo que comprende SEC ID Nº: 166 - 170 y 172. 8. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 en la que al menos uno de dichos componentes oligonucleotídicos o facilitador de ensamblaje o sustrato o una combinación de los mismos comprende adicionalmente al menos un aptámero o parte del mismo. 9. La composición de la reivindicación 8 en la que dichos aptámeros o parte de los mismos están comprendidos por al menos uno de ácido nucleico, péptido, polipéptido o proteína o un derivado o combinación de los mismos. 10. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 que comprende adicionalmente un inhibidor de dicho autoensamblaje de dicha MNAzima. 11. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10 en la que al menos uno de dicho primer o segundo componentes oligonucleotídicos o dicho facilitador de ensamblaje o dicho sustrato comprende adicionalmente al menos una parte de secuencia autocomplementaria capaz de formar una estructura en horquilla. 12. La composición de la reivindicación 11 en la que dicha estructura en horquilla inhibe el autoensamblaje de dicha MNAzima. 13. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12 en la que dicho facilitador de ensamblaje es un ácido nucleico o una proteína. 14. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en la que dicho sustrato comprende adicionalmente al menos una nanopartícula o micropartícula o combinación de las mismas. 15. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en la que dicho sustrato comprende una parte detectable y una parte interruptora, en la que tras la modificación de dicho sustrato por dicha MNAzima un efecto detectable proporcionado por dicha parte detectable aumenta o se reduce. 16. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-15 en la que dicha modificación de dicho sustrato 114   por dicha MNAzima proporciona un efecto detectable. 17. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-16 en la que dicha modificación de dicho sustrato se selecciona del grupo que comprende escisión, ligación, metalación de porfirina, formación de enlaces carbonocarbono, enlaces éster o enlaces amida o cualquier combinación de los mismos. 18. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-17 en la que al menos uno de dichos componentes oligonucleotídicos, dicho facilitador de ensamblaje, dicho sustrato o dicho inhibidor se selecciona del grupo que comprende ADN, ARN, análogos de ácidos nucleicos, ácidos péptido nucleicos, ácidos nucleicos bloqueados, quimeras de ácido nucleico-péptido o una combinación de los mismos. 19. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-18 en la que dichos facilitador de ensamblaje y dicho sustrato son ácidos nucleicos que son completamente o parcialmente complementarios a al menos parte de dicho primer o segundo componente oligonucleotídicos. 20. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-19 que comprende adicionalmente al menos un tercer componente oligonucleotídico y un cuarto componente oligonucleotídico que se autoensamblan en presencia de al menos un facilitador de ensamblaje adicional para formar al menos una MNAzima catalíticamente activa adicional, en la que cada uno de dichos al menos tercer y cuarto componentes oligonucleotídicos comprenden una pare de rama de sustrato, una parte de núcleo catalítico y una parte de rama sensora; en la que tras el autoensamblaje de al menos un tercer componente oligonucleotídico y un cuarto componente oligonucleotídico, la parte de rama sensora de dicho al menos tercer y dicho al menos cuarto componentes oligonucleotídicos forman ramas sensoras de dicha al menos una MNAzima catalíticamente activa adicional, la parte de rama de sustrato de dicho al menos tercer y dicho al menos cuarto componentes oligonucleotídicos forman ramas de sustrato de dicha al menos una MNAzima catalíticamente activa adicional y la parte de núcleo catalítico de dicho al menos tercer y dicho al menos cuarto componentes oligonucleotídicos forman un núcleo catalítico de dicha al menos una MNAzima catalíticamente activa adicional; y en la que las ramas sensoras de dicha al menos una MNAzima adicional interaccionan con dicho al menos un facilitador de ensamblaje adicional para mantener dicho al menos tercer y dicho al menos cuarto componente oligonucleotídico en proximidad para asociación de sus partes de núcleo catalítico respectivas para formar el núcleo catalítico de dicha al menos una MNAzima adicional, siendo dichos núcleos catalíticos capaces de actuar en al menos un sustrato adicional y en la que las ramas de sustrato de dicha al menos una MNAzima adicional se une con al menos un sustrato adicional de modo que el núcleo catalítico de dicha al menos una MNAzima adicional puede actuar en dicho al menos un sustrato adicional. 21. La composición de la reivindicación 20 en la que cada uno de los sustratos adicionales es la mismo, diferente o una combinación de los mismos. 22. Un procedimiento para detectar la presencia de al menos un facilitador de ensamblaje que comprende: (a) proporcionar dos o más componentes oligonucleotídicos, en los que al menos un primer componente oligonucleotídico y un segundo componente oligonucleotídico se autoensamblan en presencia de al menos un primer facilitador de ensamblaje para formar al menos una primera enzima de ácido nucleico multicomponente (MNAzima) catalíticamente activa; (b) proporcionar al menos un primer sustrato, siendo capaz dicho primer sustrato de modificarse por dicha primera MNAzima, proporcionando dicha modificación de dicho sustrato por dicha MNAzima un efecto detectable; (c) poner en contacto dichos dos o más componentes oligonucleotídicos con una muestra que potencialmente contiene dicho al menos primer facilitador de ensamblaje en condiciones que permiten: (1) el autoensamblaje de dicha al menos primera MNAzima y (2) la actividad catalítica de dicha al menos primera MNAzima; y (d) detectar dicho efecto detectable, detectando de este modo la presencia de dicho al menos un facilitador de ensamblaje. 23. El procedimiento de la reivindicación 22 en el que al menos uno de dichos componentes oligonucleotídicos, facilitador de ensamblaje o sustrato está comprendido por ADN o un análogo del mismo. 24. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 22-23 en el que al menos uno de dicho facilitador de ensamblaje, dicho primer o segundo componentes oligonucleotídicos o sustrato o combinación de los mismos está comprendido por más de una molécula. 25. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 23-24 en el que dicho facilitador de ensamblaje es un ácido nucleico o una proteína. 26. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 22-25 que comprende adicionalmente proporcionar al   menos un tercer y cuarto componente oligonucleotídico, en el que dicho al menos tercer y al menos cuarto componente oligonucleotídico es capaz de autoensamblarse en presencia de al menos un facilitador de ensamblaje adicional para formar al menos una MNAzima catalíticamente activa adicional y en el que al menos un sustrato adicional está presente en la muestra, siendo capaz dicho sustrato adicional de modificarse solamente por la MNAzima adicional, proporcionando dicha modificación un efecto detectable adicional. 27. El procedimiento de la reivindicación 26 en el que dicho un sustrato adicional se une a al menos un soporte insoluble de modo que se produce un efecto detectable cuando el sustrato se modifica por su MNAzima respectiva. 28. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 27 en el que al menos un de dichos primer y segundo componentes oligonucleotídicos comprende adicionalmente al menos un aptámero; y en el que dichas condiciones permiten (1) unión de dicho facilitador de ensamblaje con dicho al menos un aptámero y (2) modificaciones catalíticas de dicho sustrato por dicha MNAzima; y determinar la presencia de la modificación catalítica de la MNAzima, siendo la presencia de la modificación catalítica indicativa de la presencia de dicho facilitador de ensamblaje. 29. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 22-28 que comprende adicionalmente proporcionar al menos un primer inhibidor que es capaz de inhibir dicho autoensamblaje de dicha MNAzima catalíticamente activa en ausencia de dicho facilitador de ensamblaje. 30. El procedimiento de la reivindicación 29 en el que al menos uno de dichos componentes oligonucleotídicos, facilitador de ensamblaje o aptámero comprende adicionalmente dicho inhibidor. 31. El procedimiento de la reivindicación 30 en el que dicha inhibición de autoensamblaje de dicha MNAzima catalíticamente activa se retira tras el contacto de dicho aptámero con dicho facilitador de ensamblaje. 32. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 29-31 en el que dicho inhibidor es capaz de unirse al menos a uno de dicho aptámero o parte del mismo. 33. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 22-32 en el que dicho efecto detectable se mide cuantitativa o cualitativamente. 34. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 22-33 en el que el facilitador de ensamblaje es una variante de secuencia de ácido nucleico o un ácido nucleico metilado. 35. El procedimiento de la reivindicación 34 en el que la variante de secuencia se selecciona del grupo que comprende polimorfismos de nucleótido sencillo, polimorfismos de múltiples nucleótidos, inserciones, deleciones, duplicaciones, translocaciones, variantes de secuencia de desplazamiento de fase, variantes de secuencia sin sentido o cualquier combinación de los mismos. 36. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 22-35 en el que uno o ambos de dicho primer componente oligonucleotídico y dicho segundo componente oligonucleotídico están comprendidos por más de una molécula. 37. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 34 o 35 que comprende adicionalmente una etapa de amplificar dicha variante de secuencia de ácido nucleico. 38. El procedimiento de la reivindicación 37 que comprende adicionalmente la determinación de la presencia de dicha variante de secuencia de ácido nucleico durante o después de dicha amplificación. 39. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 34 o 35 en el que la ausencia de la actividad catalítica es indicativa de la presencia de dicha variante de secuencia. 40. El procedimiento para detectar un ácido nucleico metilado de la reivindicación 34 en el que dichas condiciones comprenden adicionalmente una temperatura que facilita la hibridación de dicha MNAzima con dicho ácido nucleico metilado pero no con ácido nucleico no metilado. 41. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 22-38 o 40 que comprende adicionalmente amplificar el efecto detectable mediante el uso de una cascada de amplificación de efecto detectable. 42. El procedimiento de la reivindicación 41 en el que la cascada de amplificación de efecto detectable comprende una o más de una cascada de ribozima/ligasa, una cascada de enzima de ácido nucleico circular, una cascada de enzima proteica o una o más enzimas unidas a un soporte o cualquier combinación de las mismas. 43. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 22-42 que comprende adicionalmente proporcionar un soporte insoluble que tiene al menos uno de dicho sustrato o dicho primer o segundo componentes 116   oligonucleotídicos, o dicho inhibidor, o dicho facilitador de ensamblaje, o una combinación de los mismos unida al mismo. 44. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 22-38 o 39-43 en el que dicho efecto detectable se detecta por espectroscopía de fluorescencia, resonancia de plasmón superficial, espectroscopía de masas, RMN, resonancia de spin electrónico, espectroscopía de fluorescencia de polarización, dicroísmo circular, inmunoensayo, cromatografía, radiometría, fotometría, gammagrafía, procedimientos electrónicos, espectroscopía de UV, luz visible o infrarrojos, procedimientos enzimáticos o cualquier combinación de los mismos. 45. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 22-44 en el que dicho sustrato comprende una parte detectable y una parte interruptora, en el que tras la modificación de dicho sustrato por dicha MNAzima, un efecto detectable proporcionado por dicha parte detectable aumenta o se reduce. 46. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 22-45 en el que dicha modificación se selecciona del grupo que comprende escisión, ligación, instalación de porfirina, formación de enlaces carbono-carbono, enlaces éster o enlaces amida. 47. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 26-46 en el que dicho al menos un efecto detectable adicional es detectable de forma independiente. 48. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 26-46 en el que cada uno de los sustratos adicionales son el mismo, diferentes o una combinación de los mismos. 49. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 26-46 en el que al menos uno de cada sustrato adicional se une a un soporte insoluble de modo que solamente una de una parte detectable y una parte interruptora del sustrato adicional permanece unida al soporte cuando dicho sustrato adicional se modifica por dicha MNAzima adicional. 50. El procedimiento de la reivindicación 22 que comprende adicionalmente proporcionar un soporte insoluble que tiene al menos dicho primer sustrato unido al mismo, dicho primer sustrato es capaz de modificarse por dicha MNAzima, en el que dicho primer sustrato comprende adicionalmente al menos una tercera molécula que comprende al menos una primera enzima catalíticamente activa que se libera tras la modificación de dicho primer sustrato por dicha primera MNAzima. 51. El procedimiento de la reivindicación 50 que comprende adicionalmente proporcionar un soporte insoluble que tiene al menos un segundo sustrato unido al mismo, dicho segundo sustrato escindible por dicha primera enzima catalíticamente activa comprendiendo dicho segundo sustrato al menos una cuarta molécula que comprende al menos un resto detectable que se libera a través de la modificación de dicho segundo sustrato por dicha primer enzima; y (a) en el que dicha primera enzima catalíticamente activa modifica una pluralidad de dicho segundo sustrato liberando de este modo una pluralidad de restos detectables (b) en el que dichos restos detectables son detectables después de modificación de dicho segundo sustrato por dicha primera enzima catalíticamente activa y; (c) en el que la detección de dichos restos detectables es indicativa de la presencia de dicho facilitador de ensamblaje. 52. El procedimiento de la reivindicación 51 en el que dichos restos detectables comprenden adicionalmente una segunda enzima catalíticamente activa adicional capaz de modificar dicho primer sustrato liberando de este modo enzima catalíticamente activa adicional. 53. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 50 a 52 en el que al menos una de dicha primera o dicha segunda enzimas catalíticamente activas se selecciona del grupo que comprende MNAzimas, ADNzimas, ribozimas, enzimas hidrolíticas, endonucleasas de restricción, exonucleasas, proteasas, proteinasas, hidrolasas, liticasas, peptidasas, dipeptidasas, esterasas, caspasas, catepsinas, desulfhidrasas, amidasas, glucosidasas. 54. Un procedimiento para preparar una pluralidad de enzimas de ácido nucleico multicomponentes (MNAzimas) que reconocen cada una al menos un facilitador de ensamblaje y modifican un sustrato, comprendiendo el procedimiento: (a) proporcionar una pluralidad de facilitadores de ensamblaje a identificar, detectar o cuantificar, (b) diseñar dos o más componentes oligonucleotídicos en los que al menos un primer componente oligonucleotídico y un segundo componente oligonucleotídico se autoensamblan en presencia de un facilitador de ensamblaje para formar una enzima de ácido nucleico multicomponente (MNAzima) catalíticamente activa, en que cada uno de los al menos primer y segundo componentes oligonucleotídicos comprende una parte de rama de sustrato, una parte de núcleo catalítico y una parte de rama sensora, en el que tras el autoensamblaje, la parte de rama sensora del primer y segundo componentes oligonucleotídicos forman ramas sensoras de la MNAzima, la parte de rama de sustrato del primer y segundo componentes oligonucleotídicos forman ramas de 117   sustrato de la MNAzima y la parte del núcleo catalítico del primer y segundo componentes oligonucleotídicos forman un núcleo catalítico de la MNAzima; y en el que las ramas sensoras de la MNAzima interaccionan con un facilitador de ensamblaje de modo que mantienen el primer y segundo componentes oligonucleotídicos en proximidad para asociación de sus partes de núcleo catalítico respectivas para formar el núcleo catalítico de la MNAzima, dicho núcleo catalítico capaz de actuar en al menos un sustrato, y en el que las ramas de sustrato de la MNAzima se unen a un sustrato de modo que el núcleo catalítico de la MNAzima pueda modificar dicho sustrato; (c) alterar dichos dos o más componentes oligonucleotídicos de modo que la parte de rama de sustrato y la parte de núcleo catalítico del primer y segundo componentes oligonucleotídicos sea constante y la parte de rama sensora de al menos uno del primer y segundo componentes oligonucleotídicos se adapte para reconocer otro de la pluralidad de facilitadores de ensamblaje y (d) repetir la etapa de alteración para cada uno de la pluralidad de facilitadores de ensamblaje. 55. Uso de al menos un oligonucleótido como un sustrato de enzima de ácido nucleico multicomponente (MNAzima) en el que dicho sustrato se modifica por dicha MNAzima después de la unión de dicho sustrato por las ramas de sustrato de dicha MNAzima. 56. Un procedimiento para fabricar MNAzimas que incorporan secuencias parciales de una ADNzima; ensayando las secuencias de núcleo catalítico parcial derivadas de un núcleo catalítico de ADNzima que, tras la incorporación en partezimas, generan MNAzimas funcionalmente activas; o identificando qué posiciones dentro de una secuencia de núcleo catalítico de ADNzima son adecuadas para dividir en secuencias de núcleo catalítico parcial que, tras la incorporación en partezimas, dan como resultado MNAzimas funcionalmente activas; comprendiendo dicho procedimiento: a) dividir la secuencia de núcleo catalítico de dicha ADNzima; b) incorporar las secuencias de núcleo catalítico parcial resultantes en partezimas; y c) detectar actividad de MNAzima funcional en presencia de un facilitador de ensamblaje para determinar qué combinación de dichas secuencias de núcleo catalítico parcial en dichas partezimas es compatible con la formación de MNAzimas activas. 118   119     121   122   123   124     126   127   128   129     131   132   133   134     136   137   138   139     141   142   143