PROCEDIMIENTO DE ENSAYO DEL ÁCIDO HIALURÓNICO UTILIZANDO UNA PROTEÍNA DE UNION AL ÁCIDO HIALURÓNICO.

Procedimiento de ensayo del ácido hialurónico utilizando una proteína de unión al ácido hialurónico Campo técnico La presente invención se refiere a un procedimiento para medir el ácido hialurónico, que tiene buena estabilidad de almacenamiento y que ofrece un alto grado de exactitud en la medición, y a un kit de reactivos para el mismo. Antecedentes de la técnica El ácido hialurónico está presente principalmente en el líquido sinovial y en el humor vítreo ocular de los animales y en el tejido conectivo, tal como en el cordón umbilical y la dermis superior de los animales. Se sabe que la concentración de ácido hialurónico en la sangre aumenta en pacientes con artritis reumatoide, cáncer y enfermedades hepáticas y es un marcador útil conocido para el diagnóstico de estas enfermedades, y por consiguiente, se han desarrollado hasta la fecha diversos procedimientos para la medición del ácido hialurónico. Por ejemplo, el documento WO 02/10138A presenta un procedimiento de ensayo homogéneo para la detección del ácido hialurónico que evita el uso de una fase sólida. El procedimiento se basa en una proteína de unión al ácido hialurónico marcada. Por otra parte, para la medición por medios inmunológicos, se han estado utilizando ampliamente procedimientos que usan partículas de látex debido a su sencillo procedimiento y a la posibilidad de aplicación en dispositivos de medición de varios analitos. El documento JP-A-8193999 se refiere a un procedimiento de inmunoensayo dirigido a la detección general de interacciones entre antígeno y anticuerpo. En particular, un complejo inmune I formado por anticuerpo/antígeno, por ejemplo, en una muestra de sangre, es detectado por otro anticuerpo específico, que pueden estar fijado en un vehículo insoluble que actúa como soporte. No se menciona la aplicación del procedimiento al ácido hialurónico. El documento JP-A-11014628 presenta un procedimiento de ensayo diseñado para evitar la dependencia de las interacciones entre antígeno y anticuerpo. En una forma de realización, se inmoviliza una proteína de unión al ácido hialurónico directamente en un vehículo, y de ese modo pueden realizarse ensayos en las muestras biológicas (por ejemplo, sangre) para detectar y cuantificar el ácido hialurónico. El procedimiento que utiliza partículas de látex como reactivo para medir el ácido hialurónico ha sido descrito, por ejemplo, en el documento JP-B-3424504. En la publicación de patente citada anteriormente, se ha descrito un procedimiento que comprende los procesos de fijación de una proteína de unión al ácido hialurónico en partículas de vehículo como soporte, formación de un complejo de reacción entre las partículas y el ácido hialurónico de una muestra y determinación del ácido hialurónico por medio de la detección del complejo de reacción. En los Ejemplos de la publicación de patente citada anteriormente, los experimentos se han llevado a cabo utilizando partículas de látex con un tamaño de partícula promedio de 368 nm de diámetro. Sin embargo, cuando tales partículas se utilizan como reactivo, por lo general, las partículas de látex tienen que dispersarse mediante agitación o similar antes de su uso, puesto que las partículas de látex con un tamaño de partícula promedio de 300 nm (0,3 µm) de diámetro o mayores tienen tendencia a depositarse con facilidad. Por lo tanto, para la medición del ácido hialurónico utilizando un vehículo tal como las partículas de látex, se ha deseado el desarrollo de un reactivo que no se deposite con facilidad y que no necesite un tratamiento engorroso como la agitación antes de su uso. Literatura de Patente 1: JP-B-3424504 Literatura de Patente 2: WO 02/101389A Literatura de Patente 3: JP-A-8 193999 Literatura de Patente 4: JP-A-11014628A Divulgación de la invención Problema a resolver por la invención Teniendo en cuenta la situación anterior, es un objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento que utiliza un vehículo para la medición del ácido hialurónico en el que el depósito del vehículo es inferior, la estabilidad del almacenamiento es buena y tiene una exactitud de medición del mismo alto grado que la medición realizada por medio de los reactivos convencionales, como así también un kit de reactivos para el mismo. Medios para resolver el problema Para almacenar un reactivo que contiene partículas de látex para la medición del ácido hialurónico en una manera más estable, los presentes inventores han investigado para encontrar un procedimiento de fijación de una proteína de unión al ácido hialurónico (a continuación en el presente documento, denominada de manera opcional HABP) en partículas de látex con menor depósito (tamaño de partícula promedio: 0,3 µm de diámetro o menor) por medio de enlaces químicos o adsorción física. No obstante, resultó difícil fijar de manera eficaz la HABP en las partículas de látex, y por lo tanto, la medición no pudo llevarse a cabo con un alto grado de exactitud. A continuación, como resultado del estudio intensivo, los inventores encontraron que la reacción de aglutinación de las partículas de látex 2   según la cantidad de ácido hialurónico podía inducirse con eficacia por medio de la reacción de las partículas de látex, que de manera preliminar se habían sensibilizado con un anticuerpo monoclonal para HABP, con un complejo formado entre HABP y ácido hialurónico. Además, los presentes inventores han encontrado que puede prepararse un reactivo para la medición del ácido hialurónico con buena estabilidad de almacenamiento si se almacenan las partículas de látex, que previamente se han sensibilizado con un anticuerpo monoclonal para HABP y la proteína de unión al ácido hialurónico, de manera individual como reactivos separados. Además, los inventores han encontrado que, como se describió anteriormente, la etapa puede continuar mediante la formación previa de un complejo por medio de la reacción entre el ácido hialurónico y HABP, y a continuación haciendo reaccionar el complejo con las partículas de látex sensibilizadas con un anticuerpo monoclonal para HABP, y por consiguiente completaron la presente invención. Es decir, la presente invención se refiere a "un procedimiento para medir el ácido hialurónico que comprende la formación de un complejo de ácido hialurónico/HABP poniendo en contacto el ácido hialurónico de una muestra con HABP, hacer reaccionar dicho complejo con un vehículo que actúa como soporte de los anticuerpos anti-HABP, medir el cambio óptico del producto de la aglutinación generada por dicha reacción y calcular la cantidad de ácido hialurónico a partir del valor medido" y a un kit de reactivos para la medición del ácido hialurónico que comprende un reactivo que comprende HABP y un reactivo que comprende un vehículo que actúa como soporte de anticuerpos anti-HABP". Efecto de la invención De acuerdo con el procedimiento de medición de la presente invención, en comparación con el procedimiento convencional, la medición puede llevarse a cabo mediante un simple procedimiento, sin necesidad de agitar el reactivo antes de su uso, y también, la medición puede llevarse a cabo con el mismo alto grado de exactitud al de la medición con los reactivos convencionales. Además, el kit de reactivos de la presente invención proporciona un menor depósito del vehículo y buena estabilidad de almacenamiento; además, usando dicho kit de reactivos, la medición del ácido hialurónico puede lograrse con el mismo grado de exactitud al de la medición con los reactivos convencionales. Mejor modo de llevar a cabo la invención Como proteína de unión al ácido hialurónico (HABP), en lo que respecta a la presente invención, puede adoptarse sin limitación específica una cualquiera de las proteínas que contienen una región de unión al ácido hialurónico que tiene la propiedad de unirse al ácido hialurónico, tales como proteoglicano, proteína link y hialuronectina, y puede incluir la misma proteína descrita anteriormente, una proteína parcial que contenga la región de unión al ácido hialurónico de la proteína descrita anteriormente, una sustancia que contenga tal proteína parcial, y una proteína de recombinación producida por la incorporación de un fragmento del gen que codifica la región de unión al ácido hialurónico de la proteína descrita anteriormente en otra proteína. Como anticuerpo anti-HABP, en lo que respecta a la presente invención, puede adoptarse cualquier anticuerpo contra HABP, ya sea monoclonal o policlonal. Resulta de preferencia un anticuerpo policlonal o monoclonal, purificado por medio de cromatografía de afinidad con un único epítopo, y resulta particularmente de preferencia un anticuerpo monoclonal capaz de unirse de manera eficaz con el ácido hialurónico. Entre estos, resulta... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para medir el ácido hialurónico que comprende: formar un complejo de ácido hialurónico/proteína de unión al ácido hialurónico poniendo en contacto ácido hialurónico de una muestra con la proteína de unión al ácido hialurónico, hacer reaccionar dicho complejo con una partícula de látex que soporta los anticuerpos anti-proteína de unión al ácido hialurónico, cuyo diámetro es de 0,05 a 0,3 µm, medir el cambio óptico producido por la aglutinación del producto generado por dicha reacción y calcular la cantidad de ácido hialurónico a partir del valor medido. 2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que la proteína de unión al ácido hialurónico es una seleccionada de proteoglicano, proteína link y hialuronectina. 3. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que el cambio óptico es el cambio de turbidez o el cambio de absorbancia o el cambio de la intensidad de luz dispersada. 4. Un kit de reactivos para la medición de ácido hialurónico según el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que comprende un reactivo que comprende una proteína de unión al ácido hialurónico y un reactivo que comprende una partícula de látex que soporta los anticuerpos anti proteína de unión al ácido hialurónico cuyo diámetro es de 0,05 a 0,3 µm.