ENSAYO DE MRNA DE E6, E7 DE HPV Y MÉTODOS DE EMPLEO DEL MISMO.

Ensayo de MRNA de E6, E7 de HPV y métodos de empleo del mismo CAMPO TÉCNICO El invento se refiere, en general, a un ensayo de mRNA de HPV para la detección de trastornos relacionados con HPV tales como el cáncer cervical y lesiones cervicales. Más específicamente, el invento se refiere a un ensayo que permite identificar y cuantificar mRNA de E6, E7 de HPV en células cervicales. El Ensayo de mRNA de E6, E7 de HPV, al que aquí se hace referencia como "Ensayo de HPV en Célula", permite una detección sensible y específica de células anormales cancerosas y precancerosas así como de células normales que experimentan una transformación maligna. FUNDAMENTO DEL INVENTO El cáncer cervical afecta a aproximadamente 13.000 mujeres al año en los Estados Unidos y a más de 400.000 mujeres en todo el mundo. El noventa por ciento de los cánceres cervicales contiene las cepas de alto riesgo 16 y 18 de DNA de HPV ("HPV-16" y "HPV-18", respectivamente). Por contraste, los HPVs de bajo riesgo, tales como HPV-6 y HPV-11, raramente se desarrollan hasta un cáncer. La presencia de HPVs de bajo riesgo y alto riesgo es identificada por medio del uso de la reacción en cadena de la polimerasa ("PCR"; del inglés, polymerase chain reaction) o del Ensayo Hybrid Capture ® II para HPV ("Ensayo HC II para HPV"; Digene Corp., Gaithersburg, Maryland, EE.UU.). Patterson et al. (2002), "High throughput cervical cancer screening using intracellular HPV E6, E7 mRNA quantification by ultrasensitive fluorescence in situ hybridization and flow cytometry", Acta Cytologica 46 (1): 206-207, describen un ensayo para la exploración de alta eficacia del cáncer cervical mediante un inmunofenotipaje y una hibridación ultrasensible in situ con fluorescencia simultáneos para mRNA de E6, E7 de HPV. Además, en el Documento WO 99/29890 se describe un método para evaluar la fase y el pronóstico de una infección por papilomavirus humano (HPV; del inglés, human papilloma virus) midiendo el nivel de expresión de dos o más genes de HPV, por ejemplo, los genes E6, E7, L1 y E2 de HPV, en un estado morboso y comparando su expresión entre sí o con genes de referencia. El frotis de Papanicolaou ("Pap") permite evaluar el riesgo de cáncer cervical de una paciente por examen de la presencia de lesiones intraepiteliales escamosas ("SILs"; del inglés, squamous intraepithelial lesions) en la cérvix. El frotis de Pap ha sido la norma de atención en los EE.UU. a lo largo de 50 años, dando lugar a una disminución del 74% en las muertes debidas al cáncer cervical. Sin embargo, el frotis de Pap no está exento de desventajas; en particular, errores en el muestreo cervical y la interpretación contribuyen a una sensibilidad del frotis de Pap de sólo el 58% [Hakama, Screening for Cervical Cancer, CANCER TREND RES. 86: 41-49 (1996); Nanda et al., Accuracy of the Papanicolaou Test in Screening for and Follow-up of Cervical Cytologic Abnormalities, ANN. INTERN. MED. 132: 810-819 (2000)]. En 1996, la "Food and Drug Administration" aprobó el Ensayo de Pap ThinPrep ® (Cytec Corp., Marlborough, Massachusetts, EE.UU.) como una alternativa al frotis convencional de Pap para la exploración de SILs. El ensayo de Pap ThinPrep permite explorar SILs usando una citología de base líquida ("LBC"; del inglés, liquid based cytology) con una producción automatizada de portaobjetos con monocapas. El uso de LBC ha dado lugar a un aumento de muestras adecuadas y de la detección de SILs; sin embargo, las muestras para LBC tienen una sensibilidad de sólo el 80% [Corkill et al., Specimen Adequacy of the ThinPrep Sample Preparations in a Directto-Vial Study, ACTA CYTOL. 41: 39-44 (1997); Wilbur et al., Clinical Trials of the CYTORICH Specimen-Preparation Device for Cervical Cytology, ACTA CYTOL. 41: 24-29 (1997)]. Aunque el ciclo vital del HPV indica que las mujeres con HPVs de alto riesgo desarrollarán SILs de grado bajo ("LGSILs"; del inglés, low grade SILs; es decir, SILs de una lesión premaligna precoz) o SILs de grado elevado ("HGSILs"; del inglés, high grade SILs; es decir, SILs de una lesión premaligna avanzada) y evolucionarán hasta un cáncer, mientras que las mujeres con HPVs de bajo riesgo, no, en realidad, sólo una minoría de las mujeres infectadas con HPVs de alto riesgo y que presentan LGSILs o HGSILs evolucionará hasta el cáncer. En la tabla siguiente se muestran los índices de regresión y progreso de mujeres a quienes se ha diagnosticado ASCUS (células escamosas anormales de significación indeterminada; del inglés, abnormal squamous cells of undetermined significance), LGSILs y HGSILs por medio del frotis de Pap o de la LBC [de Melnikow et al., Natural History of Cervical Squamous Intraepithelial Lesions: A Meta-Analysis, J. OBSTET. GYNECOL. 92: 727-735 (1998); véase también Woodman et al., Natural History of Cervical Human Papillomavirus Infection in Young Women: A Longitudinal Cohort Study, LANCET 357: 1831-1836 (2001)]: CITOLOGÍA REGRESIÓN HASTA LA NORMALIDAD PROGRESO HASTA UN GRADO MAYOR A LO LARGO DE 24 MESES 2 PROGRESO HASTA UN CÁNCER INVASIVO A LO LARGO DE 24 MESES   CITOLOGÍA REGRESIÓN HASTA LA NORMALIDAD PROGRESO HASTA UN GRADO MAYOR A LO LARGO DE 24 MESES 3 PROGRESO HASTA UN CÁNCER INVASIVO A LO LARGO DE 24 MESES ASCUS 68% 7% 0,25% LGSIL 47% 21% 0,15% HGSIL 35% 23% 1,44% Como demuestran los datos de la tabla precedente, la mayoría de las mujeres a quienes se ha diagnosticado ASCUS, LGSILs y HGSILs no evoluciona hasta un cáncer; en consecuencia, el frotis de Pap tradicional y el ensayo de LBC, que meramente permiten identificar la presencia de SILs anormales, no son ensayos eficaces para distinguir lesiones benignas de lesiones con un potencial maligno. Similarmente, puesto que la mayoría de las mujeres a quienes se ha diagnosticado ASCUS, LGSILs y HGSILs está normalmente infectada con un HPV de alto riesgo, resulta que la identificación de una infección con un HPV de alto riesgo no es un indicador biológicamente relevante para la detección del cáncer cervical. Por lo tanto, existe en la técnica la necesidad de un método mucho más sensible mediante el cual explorar el cáncer cervical. SUMARIO DEL INVENTO El presente invento supera la necesidad anteriormente mencionada de la técnica al proporcionar ensayos para explorar el cáncer cervical explorando, detectando y cuantificando mRNA intracelular de E6, E7 de HPV en células cervicales. Que sepa el inventor, no se ha publicado ni descrito previamente dicho ensayo para mRNA de E6, E7 de HPV. Un aspecto del invento es un ensayo in vitro para determinar la transformación maligna de células cervicales, ensayo que comprende identificar y cuantificar la expresión de mRNA de E6, E7 de HPV en las células cervicales sobre una base por célula, en que la transformación maligna de las células cervicales viene indicada por la expresión de 200 o más copias de mRNA de E6, E7 de HPV por célula. Se describe aquí un ensayo para determinar la transformación maligna de células cervicales, que comprende las operaciones de: (a) obtener células cervicales de un individuo; (b) preparar las células cervicales como una muestra para citología de base líquida (LBC); y (c) hibridar la muestra para LBC usando oligonucleótidos específicos para mRNA de E6, E7 de HPV, en que la expresión de mRNA de E6, E7 de HPV indica la transformación maligna de las células cervicales. Aquí, el mRNA de E6, E7 de HPV puede ser cuantificado por medio de citometría de flujo. Se describe además un método para la exploración de una paciente en cuanto a la transformación maligna de células cervicales, que comprende identificar la expresión de mRNA de E6, E7 de HPV en las células cervicales. En una descripción preferida, se identifica el mRNA de E6, E7 de HPV utilizando una hibridación in situ con oligonucleótidos específicos para mRNA de E6, E7 de HPV y se cuantifica el mRNA de E6, E7 de HPV usando citometría de flujo. Generalmente, la transformación maligna de las células cervicales viene indicada por la expresión de 200 o más copias de mRNA de E6, E7 de HPV por célula. Las células cervicales que se pueden utilizar tanto en el ensayo como en el método anteriormente descritos son seleccionadas del grupo que consiste en células normales, células escamosas anormales de significación indeterminada (ASCUS), células con lesiones intraepiteliales escamosas de grado bajo (LGSILs) y células con lesiones intraepiteliales de grado elevado (HGSILs). Se describe además un método para la exploración de una paciente con células cervicales anormales en cuanto a células cervicales premalignas, que comprende cuantificar la expresión de mRNA de E6, E7 de HPV en las células cervicales, en que células que expresan 200 o más copias de mRNA de E6, E7 de HPV por célula indican células con un potencial maligno, y células que expresan menos de 200 copias de mRNA de E6, E7 de HPV indican... [Seguir leyendo]

1. Un ensayo in vitro para determinar una transformación maligna de células cervicales, ensayo que comprende identificar y cuantificar la expresión de mRNA de E6, E7 de HPV en las células cervicales sobre una base por célula, en que la transformación maligna de las células cervicales viene indicada por la expresión de 200 o más copias de mRNA de E6, E7 de HPV por célula. 2. El ensayo de la Reivindicación 1, en que las células cervicales son seleccionadas del grupo que consiste en células normales, células escamosas anormales de significación indeterminada (ASCUS), células con lesiones intraepiteliales escamosas de grado bajo (LGSILs) y células con lesiones intraepiteliales de grado elevado (HGSILs). 3. El ensayo de la Reivindicación 1 o 2, en que células que expresan menos de 200 copias de mRNA de E6, E7 de HPV por célula indican células benignas. 4. El ensayo de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3, en que el mRNA de E6, E7 de HPV es identificado usando una hibridación in situ con oligonucleótidos específicos para mRNA de E6, E7 de HPV. 5. El ensayo de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 4, en que la expresión de mRNA de E6, E7 de HPV por célula es cuantificada usando citometría de flujo. 6. El ensayo de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 5, en que se cuantifica el porcentaje de células que expresan 200 o más copias de mRNA de E6, E7 de HPV por célula. 7. El ensayo de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 6, que comprende además preparar las células cervicales como una muestra para citología de base líquida (LBC). 8. El ensayo de la Reivindicación 7, que comprende además hibridar la muestra para citología LBC usando oligonucleótidos específicos para mRNA de E6, E7 de HPV. 9. El ensayo de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 8, que comprende además teñir las células cervicales con una combinación de CD16 y CAM 5.2, en que los neutrófilos son identificados por una tinción CD16 + , las células endocervicales columnares son identificadas por una tinción CD16 , CAM 5.2 + , y las células ectocervicales escamosas son identificadas por una tinción CD16 , CAM 5.2 . 10. El ensayo de la Reivindicación 9, en que células endocervicales columnares malignamente transformadas indican un estado cervical de preadenocarcinoma o adenocarcinoma 11. El ensayo de la Reivindicación 9, en que células ectocervicales escamosas malignamente transformadas indican un estado cervical de carcinoma de células preescamosas o carcinoma de células escamosas. 12. El ensayo de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 11, que comprende además correlacionar el porcentaje de células que expresan mRNA de E6, E7 de HPV con un diagnóstico citológico, en que el diagnóstico citológico es HGSIL cuando el porcentaje de células que expresan mRNA de E6, E7 de HPV es significativamente mayor que el porcentaje de células que expresan mRNA de E6, E7 de HPV en WNLs (p<0,001), ASCUS (p<0,001) y LGSIL (p<0,001), o el diagnóstico citológico es LGSIL cuando el porcentaje de células que expresan E6, E7 de HPV es significativamente mayor que el porcentaje de células que expresan E6, E7 de HPV en WNL (p<0,01). 13. El ensayo de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 12, llevado a cabo en un método para la exploración de una paciente en cuanto a la transformación maligna de células cervicales. 12   13   14     16   17   18