Un polinucleótido aislado que comprende: a. una isla CpG extendida exenta de metilación que comprende más de 3000 nucleótidos contiguos desde la región promotora de un gen rps3 de mamífero;

b. un promotor heterólogo; y c. una secuencia de ácidos nucleicos transcribible adyacente al promotor heterólogo, en el que la transcripción de dicha secuencia de ácidos nucleicos transcribible desde dicho promotor heterólogo se mejora en presencia de dicha isla CpG extendida exenta de metilación con respecto a la transcripción en ausencia de dicha isla CpG extendida exenta de metilación

ANTECEDENTES

La presente invención se refiere a polinucleótidos que comprenden elementos que confieren una expresión mejorada a unidades de transcripción unidas de manera operable. Estos elementos están asociados de manera natural a las regiones promotoras de genes de proteínas ribosómicas y, en construcciones de ADN recombinante, confieren niveles de expresión génica elevados y reproducibles. La presente invención también se refiere a vectores que comprenden dichas secuencias de polinucleótidos, a células hospedadoras que comprenden dichos vectores y al uso de dichos polinucleótidos, vectores o células hospedadoras en terapia, para la producción de proteínas recombinantes en cultivos celulares y otras aplicaciones biotecnológicas.

El modelo actual de la estructura de la cromatina en eucariotas superiores postula que los genes están organizados en quot;dominios" (Dillon, N. & Grosveld, F. Chromatin domains as potential units of eukaryotic gene function. Curr. Opin. Genet. Dev. 4, 260-264 (1994); Higgs, D.R. Do LCRs open chromatin domains? Cell 95, 299302 (1998)). Se contempla que los dominios de la cromatina se encuentren en un estado condensado, "cerrado", transcripcionalmente silente, o en una configuración descondensada, "abierta" y transcripcionalmente competente. El establecimiento de una estructura abierta de la cromatina caracterizada por una sensibilidad a la DNasa I, una hipometilación del ADN y una hiperacetilación de las histonas incrementadas se considera un requisito previo para el comienzo de la expresión génica.

La naturaleza abierta y cerrada de regiones de la cromatina está reflejada en el comportamiento de transgenes que se integran aleatoriamente en el genoma de la célula hospedadora. Construcciones idénticas

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proporcionan diferentes patrones de expresión específica de tejido y de expresión específica de la fase de desarrollo cuando se integran en localizaciones diferentes del genoma de ratón (Palmiter, R.D. & Brinster, R.L. Ann. Ref. Genet. 20, 465-499 (1986); Allen, N.D. y col. Nature 333, 852-855 (1988); Bonnerot, C., Grimber, G., Briand, P. & Nicolas, J.F. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6331-6335 (1990)).

El modelo de organización génica del dominio de la cromatina sugiere que los elementos de control genético que son capaces de establecer y mantener una estructura abierta de la cromatina transcripcionalmente competente deben estar asociados a regiones activas del genoma.

Las Regiones para el control del locus (LCRs) son una clase de elementos reguladores transcripcionales con una capacidad de reestructuración de la cromatina de largo alcance. Las LCR se definen funcionalmente en ratones transgénicos por su capacidad para conferir niveles de expresión fisiológicos que dependen del número de copias del transgen y que es independiente del sitio de integración sobre un gen unido en cis, especialmente en transgenes de una sola copia (Fraser, P. & Grosveld, F. Curr. Opin. Cell Biol 10, 361-365 (1998); Li, Q., Harju,

S. & Peterson, K.R. Trends Genet. 15: 403-408 (1999). De manera crucial, dicha expresión es específica de tejido. Las LCRs son capaces de impedir la dispersión de la heterocromatina, evitar la PEV (Kloussis, D. & Festenstein, R. Curr, Opin. Genet. Dev. 7, 614-619 (1997)) y constan de una serie de sitios hipersensibles (HS) a la DNasa I que pueden estar localizados en 5' o 3' de los genes que regulan (LI, Q., Harju, S. & Peterson, K.R. Trends Genet. 15: 403-408 (1999)).

La generación de líneas celulares de mamífero en cultivo que producen niveles elevados de un producto proteico terapéutico es una gran industria en desarrollo. Los efectos de la posición de la cromatina lo convierten

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en un proceso difícil, que requiere tiempo y caro. El enfoque más habitual usado para la producción de dichas "factorías celulares" de mamífero depende de la amplificación génica inducida por una combinación de un gen de resistencia a fármacos (por ejemplo, DHFR, glutamina sintetasa (Kaufman RJ. Methods Enzymol 185, 537566 (1990)), y el mantenimiento de una presión rigurosa y selectiva. El uso de vectores que contienen LCRs procedentes de dominios génicos muy expresados, usando células derivadas del tejido adecuado, simplifica enormemente el procedimiento, dando una elevada proporción de líneas celulares clonales que presentan unos niveles de expresión elevados y estables (Needham M, Gooding C, Hudson K, Antoniou M, Grosveld F y Hollis M. Nucleic Acids Res 20, 997-1003 (1992); Needham M, Egerton M, Millest A, Evans S, Popplewell M, Cerillo G, McPheat J, Monk A, Jack A, Johnstone D y Hollis M. Protein Expr Purif 6,124-131 (1995).

No obstante, la especificidad de tejido de las LCR, aunque es útil en algunas circunstancias, también es una limitación importante para muchas aplicaciones, por ejemplo, cuando no se conocen LCR para el tejido en el que se requiere la expresión, o cuando se requiere la expresión en muchos, o en todos los tejidos.

El documento US 6.689.606 y la solicitud de patente copendiente WO 00/0539, incorporadas en el presente documento por referencia, describen elementos que son responsables, en su contexto cromosómico natural, del establecimiento de una estructura de cromatina abierta a lo largo de un locus que consta exclusivamente de genes domésticos que se expresan de manera ubicua. Estos elementos no proceden de una LCR y comprenden islas CpG extendidas exentas de metilación.

En ADN de mamífero, el dinucleótido CpG es reconocido por una enzima ADN-metiltransferasa que metila la citosina a 5-metilcitosina. No obstante, la 5-metilcitosina es

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inestable y se convierte en timina. Como resultado, los dinucleótidos CpG se producen mucho menos frecuentemente de lo que cabría esperar por azar. Sin embargo, algunas secciones de ADN genómico presentan una frecuencia de CpG cercana a la esperada, y estas secuencias se conocen como "islas CpG". Como se usa en el presente documento una "isla CpG" se define como una secuencia de ADN, de al menos 200 pb, que tiene un contenido en GC de al menos el 50% y una relación de contenido en CpG observada/esperada de al menos 0,6 (es decir, un contenido en dinucleótidos CpG de al menos el 60% de lo que cabría esperar por azar) (Gardiner-Green M y Frommer M. J Mol Biol 196, 261-282 (1987); Rice P, Longden I y Bleasby A Trends Genet 16, 276-277 (2000)).

Las islas CpG exentas de metilación son muy conocidas en la materia (Bird y col. (1985) Cell 40: 91-99, Tazi y Bird (1990) Cell 60: 909-920) y se pueden definir como islas CpG en las que una proporción sustancial de los restos de citosina no están metilados y que normalmente se extienden más allá de los extremos 5' de dos genes transcritos de manera divergente muy próximos en el espacio (0,1-3 kb). Se ha informado de que estas regiones de ADN permanecen hipometiladas en todos los tejidos durante el desarrollo (Wise y Pravtcheva (1999) Genomics

60: 258-271). A menudo están asociadas a los extremos 5' de genes expresados de manera ubicua, así como en un 40% de los genes que presentan un perfil de expresión restringido a determinados tejidos (Antequera, F. & Bird,

A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1195-11999 (1993); Cross, S.H. & Bird, A.P. Curr. Opin, Genet. Dev. 5, 309314 (1995)) y son conocidas por tener regiones localizadas de cromatina activa (Tazi, J. & Bird, A. Cell 60, 909-920 (1990)).

Una isla CpG "extendida" exenta de metilación es una isla CpG exenta de metilación que se extiende a través de una región que engloba más de un sitio de inicio de la

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transcripción y/o que se extiende más de 300 pb y preferentemente más de 500 pb. Los límites de la isla CpG extendida exenta de metilación se definen funcionalmente con el uso de la PCR sobre la región, en combinación con enzimas endonucleasas de restricción, cuya capacidad para digerir (cortar) el ADN en su secuencia de reconocimiento es sensible al estado de metilación de cualquier resto de CpG que haya presente. Una de esas enzimas es la HpaII, que reconoce y digiere el sitio CCGG, que se encuentra habitualmente dentro de las islas CpG, pero sólo si los restos de CG centrales no están metilados. Por tanto, la PCR llevada a cabo con ADN digerido con HpaII y sobre una región que alberga sitios HpaII, no proporciona un producto de amplificación debido a la digestión de HpaII si el ADN está sin metilar. La PCR sólo proporcionará un producto amplificado... [Seguir leyendo]

1. Un polinucleótido aislado que comprende:

a. una isla CpG extendida exenta de metilación que comprende más de 3000 nucleótidos contiguos desde la región promotora de un gen rps3 de mamífero;

b. un promotor heterólogo; y

c. una secuencia de ácidos nucleicos transcribible adyacente al promotor heterólogo, en el que la transcripción de dicha secuencia de ácidos nucleicos transcribible desde dicho promotor heterólogo se mejora en presencia de dicha isla CpG extendida exenta de metilación con respecto a la transcripción en ausencia de dicha isla CpG extendida exenta de metilación.

2. El polinucleótido según la reivindicación 1, en el que la isla CpG extendida exenta de metilación comprende adicionalmente uno o varios exones del gen rps3 de mamífero.

3. El polinucleótido según la reivindicación 1, en el que el gen rps3 de mamífero es un gen rps3 humano.

4. El polinucleótido según la reivindicación 1, en el que el gen rps3 de mamífero es un gen rps3 de roedor.

5. El polinucleótido según la reivindicación 1, en el que el gen de roedor es un gen rps3 de ratón.

6. El polinucleótido según la reivindicación 5, que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1.

7. El polinucleótido según la reivindicación 1, en el que el promotor heterólogo es un promotor constitutivo.

8. El polinucleótido según la reivindicación 7, en el que el promotor constitutivo se selecciona del grupo constituido por el promotor temprano/inmediato de citomegalovirus, SV40, EF-1α, las LTR del virus del sarcoma de Rous (RSV), o las LTR del VIH2.

9. El polinucleótido según la reivindicación 10, en el que el promotor constitutivo es el promotor temprano/inmediato de citomegalovirus.

10. El polinucleótido según la reivindicación 9, en el

que el promotor constitutivo es un promotor temprano/inmediato de citomegalovirus en conejillo de indias.

11. El polinucleótido según la reivindicación 9, en el que el promotor constitutivo es un promotor temprano/inmediato de citomegalovirus en ratón.

12. El polinucleótido según la reivindicación 1, en el que el promotor heterólogo es un promotor específico de tejido.

13. El polinucleótido según la reivindicación 12, en el que el promotor heterólogo es un promotor selectivo de tumores.

14. El polinucleótido según la reivindicación 13, en el que el promotor se selecciona del grupo constituido por promotores del antígeno carcinoembrionario (CEA), antígeno prostático específico (PSA), ciclooxigenasa-2 (COX-2), alfa-fetoproteína (AFP), tirosinasa, y los promotores basados en los factores 1-4 de linfocitos T (TCF).

15. El polinucleótido según la reivindicación 1, en el que el ácido nucleico transcribible codifica un polipéptido seleccionado del grupo constituido por un anticuerpo, un fragmento funcional de un anticuerpo que se une a un epítopo, un factor de crecimiento, una citoquina, una proteína quinasa, un receptor soluble, un receptor unido a membrana y un factor de coagulación sanguíneo.

16. Un vector que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.

17. El vector según la reivindicación 16, en el que el vector es un vector de expresión en eucariotas.

18. Un vector de expresión en eucariotas que comprende:

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a. un elemento que comprende más de 3000 nucleótidos contiguos desde la región promotora de un gen rps3 de mamífero;

b. un promotor heterólogo; y

c. un sitio de clonación múltiple, en el que una secuencia de ácidos nucleicos transcribible

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insertada en el sitio de clonación múltiple puede ser transcrita desde el promotor heterólogo y el nivel de transcripción se mejora con el elemento.

19. Una célula hospedadora que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o el vector de la reivindicación 16, 17 ó 18.

20. La célula hospedadora según la reivindicación 19, en la que las células se seleccionan del grupo constituido por CHO, NS0, BHK, HeLa, HepG2.

21. Un procedimiento de expresión de un polipéptido codificado por un ácido nucleico transcribible que comprende la inserción de un vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18 en una célula hospedadora adecuada y el cultivo de la célula hospedadora en condiciones que permitan la expresión del polipéptido.

22. Una composición farmacéutica que comprende el polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, el vector según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18 o la célula hospedadora según una cualquiera de las reivindicaciones 19 ó 20, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

23. Un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, el vector según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18 o la célula hospedadora según una cualquiera de las reivindicaciones 19 ó 20 para su uso como medicamento.