DERIVADOS ANTÍGENOS ASOCIADOS A TUMORES DE LA FAMILIA MAGE, Y SECUENCIAS DE ÁCIDOS NUCLEICOS QUE LOS CODIFICAN, USADOS PARA LA PREPARACIÓN DE PROTEÍNAS DE FUSIÓN Y DE COMPOSICIONES PARA VACUNACIÓN.

Derivados antígenos asociados a tumores de la familia mage, y secuencias de ácidos nucleicos que los codifican, usados para la preparación de proteínas de fusión y de composiciones para vacunación La presente divulgación se refiere al uso de un derivado antígeno asociado a tumores de la familia MAGE que comprende residuos de tioles derivatizados para la fabricación de una vacuna para tratar de forma inmunoterapéutica a un paciente que padece un tumor asociado a MAGE, en el que el tumor asociado a MAGE se selecciona de cáncer de mama, cáncer de vejiga, cáncer de pulmón, carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), carcinoma de células escamosas y de cabeza, carcinoma de colon y carcinoma de esófago. La presente descripción se refiere a derivados de proteínas, que comprenden un antígeno asociado a tumores, que resultan útiles en terapia de vacuna contra el cáncer. En particular los derivados de la divulgación incluyen proteínas de fusión que comprenden un antígeno codificado por la familia de genes MAGE (por ejemplo MAGE-3, MAGE-1), unido a una pareja de fusión inmunológica que proporciona epítopes de auxiliares T, tales como, por ejemplo, la forma lipidada de la proteína D de Haemophilus influenzae B; proteínas MAGE químicamente modificadas en las que los puentes disulfuro del antígeno están reducidos y los tioles resultantes están bloqueados y las proteínas MAGE genéticamente modificadas se proporcionan con una marca de afinidad y/o genéticamente modificadas para prevenir la formación de puentes disulfuro. También se describen procedimientos para purificar proteínas MAGE y para formular vacunas para tratar una gama de cánceres, que incluye, pero no se limita a, melanoma, mama, vejiga, pulmón, NSCLC, carcinoma de células escamosas y de cabeza, carcinoma de colon y carcinoma de esófago. Los antígenos codificados por la familia de genes MAGE se expresan predominantemente sobre células de melanoma (incluyendo melanoma maligno) y algunos otros cánceres incluyendo NSCLC (cáncer de pulmón de células no pequeñas), carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, carcinoma de células transitorias de vejiga y carcinoma de esófago, pero no son detectables sobre tejidos normales excepto en los testículos y placenta (Gaugler, 1994; Weynants, 1994; Patard, 1995). MAGE-3 se expresa en el 69 % de los melanomas (Gaugler, 1994), y también se puede detectar en el 44 % de NSCLC (Yoshimatsu 1988), en el 48 % de carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, en el 34 % de carcinoma de células transitorias de vejiga, en el 57 % de carcinoma de esófago, en el 32 % de cánceres de colon y en el 24 % de cánceres de mama (Van Pel, 1995); Inoue, 1995 Fujie 1997; Nishimura 1997). Los cánceres que expresan proteínas MAGE se conocen como tumores asociados a Mage. La inmunogenicidad de células de melanoma humano se ha demostrado de manera elegante en experimentos que usan cultivos mixtos de células de melanoma y linfocitos autólogos. Estos cultivos a menudo generan linfocitos T citotóxicos específicos (CTL) capaces de lisar exclusivamente las células de melanoma autólogas pero ni fibroblastos autólogos ni los linfocitos B autólogos transformados por EBV (Knuth, 1984; Anichini, 1987). Varios de los antígenos reconocidos sobre células autólogas de melanoma por estos clones de CTL están ahora identificados, incluyendo los de la familia MAGE. El primer antígeno que se podría definir a través de su reconocimiento por CTL específicos sobre células de melanoma autólogas se denomina MZ2-E (Van den Eynde, 1989) y está codificado por el gen MAGE-1 (Van der Bruggen, 1991). Los CTL dirigidos contra MZ2-E reconocen y lisan células de melanoma positivas MZ2-E de autólogos así como de otros pacientes con tal que estas células tengan el alelo HLA.A1. El gen MAGE-1 pertenece a una familia de 12 genes estrechamente relacionados, MAGE 1, MAGE 2, MAGE 3, MAGE 4, MAGE 5, MAGE 6, MAGE 7, MAGE 8, MAGE 9, MAGE 10, MAGE 11, MAGE 12, localizados en el cromosoma X y que comparten entre sí del 64 al 85 % de homología en su secuencia codificadora (De Plaen, 1994). Estos son algunas veces conocidos como MAGE A1, MAGE A2, MAGE A3, MAGE A4, MAGE A5, MAGE A6, MAGE A7, MAGE A8, MAGE A9, MAGE A10, MAGE A11, MAGE A12 (la familia MAGE A). Otros dos grupos de proteínas también son parte de la familia MAGE aunque relacionados de manera más distante. Éstos son el grupo MAGE B y MAGE C. La familia MAGE B incluye MAGE B1 (también conocido como MAGE Xp1, y DAM 10), MAGE B2 (también conocido como MAGE Xp2, y DAM 6), MAGE B3 y MAGE B4 - la familia Mage C actualmente incluye MAGE C1 y MAGE C2. En términos generales, una proteína MAGE se puede definir por contener una firma de secuencia central localizada hacia el extremo C terminal de la proteína (por ejemplo con respecto a MAGE A1 una proteína de 309 aminoácidos, la firma central corresponde a 195 - 279 aminoácidos). El patrón de consenso de la firma del núcleo se describe así como sigue en la que x representa cualquier aminoácido, los residuos del caso inferior se conservan (variantes conservadoras permitidas) y los residuos del caso superior se conservan perfectamente. Firma de la secuencia central ES 2 367 998 T3 Las sustituciones conservadoras son bien conocidas y generalmente se exponen como las matrices de puntuación por defecto en programas de ordenador de alineación de secuencias. Estos programas incluyen PAM250 (Dayhoft M. O. y col., (1978), A model of evolutionary changes in proteins, en Atlas of Protein sequence and estructure 5 (3) M. O. Dayhoft (ed.), 345 - 352), National Biomedical Research Foundation, Washington, y Blosum 62 (Steven Henikoft y Jorja G. Henikoft (1992), Amino acids sustitution matricies from protein blocks), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (Biochemistry): 10915 - 10919. 2 En términos generales, la sustitución dentro de los siguientes grupos son sustituciones conservadoras, pero las sustituciones entre los grupos se consideran no conservadas. Los grupos son: i) Aspartato / asparagina / glutamato / glutamina ii) Serina / treonina iii) lisina / arginina iv) fenilalanina / tirosina /triptófano v) Leucina / isoleucina / valina / metionina vi) Glicina / alanina ES 2 367 998 T3 En general y en el contexto de esta divulgación, una proteína MAGE será aproximadamente un 50 % idéntica en esta región central con 195 a 279 aminoácidos de MAGE A1. Varios epítopes de CTL se han identificado sobre la proteína MAGE - 3. Tal epítope, MAGE-3.A1, es una secuencia nonapeptídica localizada entre los 168 y 176 aminoácidos de la proteína MAGE-3 que constituye un epítope específico para las CTL cuando se presentan en asociación con la molécula de la clase I de MHC HLA.A1. Recientemente se han identificado dos epítopes de CTL adicionales sobre la secuencia de péptidos de la proteína MAGE-3 por su capacidad de montar la respuesta CTL en un cultivo mixto de células de melanoma y linfocitos autólogos. Estos dos epítopes tienen motivos de unión específica para los alelos HLA.A2 (Van der Bruggen, 1994) y HLA.B44 (Herman, 1996) respectivamente. El documento WO9504542 da a conocer el aislamiento y la producción del gen MAGE 1 completo y la identificación y análisis de péptidos de MAGE inmunogénicos. Se sugiere la fusión con el péptido de auxiliares T, opcionalmente a través de un espaciador. La presente divulgación proporciona derivados de la proteína MAGE. Los derivados de este tipo son adecuados para uso en las formulaciones de vacunas terapéuticas que son adecuadas para el tratamiento de diversos de tipos de tumores. En una realización de la presente divulgación, el derivado es una proteína de fusión que comprende un antígeno de la familia de proteínas MAGE unido a una pareja heteróloga. Las proteínas se pueden conjugar químicamente, pero se expresan preferentemente como proteínas de fusión recombinantes que permiten la producción de niveles incrementados en un sistema de expresión en comparación con proteínas no fusionadas. De este modo la pareja de fusión puede asistir en la proporción de los epítopes auxiliares T (pareja de fusión inmunológica), preferiblemente epítopes de los auxiliares T reconocidos por seres humanos, o asistir en la expresión de la proteína (potenciador de expresión) a rendimientos más altos que la proteína recombinante nativa. Preferentemente la pareja de fusión será tanto una pareja de fusión inmunológica como una pareja potenciadora de expresión. En una forma preferida de la divulgación, la pareja de fusión inmunológica se deriva de la proteína D, una proteína de superficie de la bacteria gram-negativa, Haemophilus influenza B (documento WO91/18926). Preferentemente, el derivado de la proteína D comprende aproximadamente el primer 1/3 de la proteína, en particular, aproximadamente los 100-110 primeros aminoácidos N terminales. Preferiblemente,... [Seguir leyendo]

1. Uso de un derivado de antígeno asociado a tumores de la familia MAGE que comprende residuos de tioles derivados para la fabricación de una vacuna para tratar de forma inmunoterapéutica a un paciente que padece un tumor asociado a MAGE, en el que el tumor asociado a MAGE se selecciona de cáncer de mama, cáncer de vejiga, cáncer de pulmón, carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), carcinoma de células escamosas y de cabeza, carcinoma de colon y carcinoma de esófago. 2. Uso como se reivindica en la reivindicación 1 en el que los tioles libres derivatizados están carboxiamidados o carboximetilados. 3. Uso como se reivindica en las reivindicaciones 1 y 2, en el que el antígeno comprende una pareja de fusión seleccionada de proteína D o un derivado de la proteína D que comprende aproximadamente el primer 1/3 de proteína D. 4. Uso como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el que el antígeno comprende una marca de afinidad. 5. Uso como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en el que la proteína D o el dicho fragmento de la misma está lipidada. 6. Uso como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en el que la proteína MAGE se selecciona del grupo: MAGE A1, MAGE A2, MAGE A3, MAGE A4, MAGE A5, MAGE A6, MAGE A7, MAGE A8, MAGE A9, MAGE A10, MAGE A11, MAGE A12, MAGE B1, MAGE B2, MAGE B3, MAGE B4, MAGE C1 y MAGE C2. 7. Uso de cualquier reivindicación precedente, en el que la vacuna comprende adicionalmente un adyuvante y/o citoquina o quimioquina inmunoestimuladora. 8. Uso de la reivindicación 7, en el que la proteína se presenta en un vehículo de emulsión de aceite en agua o agua en aceite. 9. Uso de la reivindicación 7 u 8 en el que el adyuvante comprende 3D-MPL, QS21 o un oligonucleótido CpG. 10. Uso de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 que comprende adicionalmente uno o más otros antígenos. 32 Figura 1: LPD-MAGE-3-His ES 2 367 998 T3 33 ES 2 367 998 T3 FIGURA 2: Construcción del vector de expresión pRIT 14586 34 ES 2 367 998 T3 FIGURA 3: Construcción del plásmido pRIT 14477 que expresa la proteína de fusión Prot. D 1/3-MAGE-3-cola His ES 2 367 998 T3 FIGURA 4: Análisis de transferencia de Western de la proteína LPD-MAGE-3-His Anticuerpos monoclonales anti-MAGE-3 MAb 32 y Mab 54 36 Figura 5 INMUNOGENICIDAD DE MAGE 3 EN RATONES (C57BL6) Linfoproliferación en células del bazo. ES 2 367 998 T3 72 horas de estimulación con 0,1 µg/ml de His Mage 3 sobre µperlas Grupos de ratones Incorporación de timidina 3H: línea base (CPM): 0,1 µg/ml de µperlas S1 Lipo D Mage3 His no formulada 1284 S2 LipoD Mage3 His + SBAS2 679 S3 SBAS2 S4 medio 1242 37 FIGURA 6: INMUNOGENICIDAD DE MAGE 3 EN RATONES (C57BL6) Linfoproliferación en células de los nódulos linfáticos. ES 2 367 998 T3 72 horas de estimulación con 1 µg/ml de His Mage 3 sobre µperlas Grupos de ratones Incorporación de timidina 3H: línea base (CPM): 1 µg/ml de µperlas LN1 Lipo D Mage3 His no formulada 477 LN2 LipoD Mage His + SBAS2 LN3 SBAS2 251 LN4 medio 38 FIGURA 7: INMUNOGENICIDAD DE MAGE 3 EN RATONES (BalbC) Linfoproliferación en células del bazo. ES 2 367 998 T3 72 horas de estimulación con 0,1 µg/ml de His Mage 3 (A) His Mage 3 revestida sobre µperlas (B) Grupos de ratones Incorporación de timidina 3H: cpm ninguna 0,1 µg/ml de µperlas S1 Lipo D Mage3 His no formulada 1002 1329 S2 LipoD Mage3 His + SBAS2 1738 4997 S3 SBAS2 3393 S4 medio 1129 39 FIGURA 8: ES 2 367 998 T3 INMUNOGENICIDAD DE MAGE 3 EN RATONES (BalbC) Linfoproliferación en células de los nódulos linfáticos poplíteos. 72 horas de estimulación con 1 µg/ml de His Mage 3 (A) His Mage 3 revestida sobre µperlas (B) Grupos de ratones Incorporación de timidina 3H: cpm ninguna 1 µg/ml de µperlas LN1 Lipo D Mage3 His no formulada 309 386 LN2 LipoD Mage3 His + SBAS2 438 LN3 SBAS2 522 637 LN4 medio 318 399 ES 2 367 998 T3 Anticuerpos anti-Mage3 en el suero de ratones inmunizados con LipoD Mage3 His en SBAS2 o no 41 ES 2 367 998 T3 Respuestas de anticuerpos específicos de subclase en ratones BalbC 42 ES 2 367 998 T3 Respuestas de anticuerpos específicos de subclase en ratones C57BL/6 43 ES 2 367 998 T3 44 Figura 13 Construcción de plásmido pRIT14426 ES 2 367 998 T3 Figura 14: Mapa de plásmido de pRIT14426 ES 2 367 998 T3 46 ES 2 367 998 T3 47 Figura 16: construcción del plásmido pRIT 14613. ES 2 367 998 T3 48 Figura 17 construcción de pRIT 14614 ES 2 367 998 T3 49 ES 2 367 998 T3 Figura 19 Figura 19: construcción del plásmido pRIT 14646 ES 2 367 998 T3 51