CUANTIFICACIÓN DEL ARNM DE CÉLULAS INDIVIDUALES CON RT-PCR EN TIEMPO REAL.

Cuantificación del ARNm de células individuales con RT-PCR en tiempo real Sector técnico La presente invención da a conocer un método para la determinación del ARNm en células de mamífero individuales. Utilizando una PCR (reacción en cadena de la polimerasa) cuantitativa, conjuntamente con procedimientos optimizados para la recolección, lisis y transcripción inversa de las células, el método permite el estudio del número, distribución, correlaciones e inducción génica de transcritos a nivel de células individuales. Técnica previa Las células de una población son en muchos aspectos singulares en sus características, incluso en un cultivo o tejido aparentemente homogéneo. Los niveles de expresión génica muestran grandes variaciones de una célula a otra, debido a factores de origen externo (extrínsecos) e interno (intrínsecos) [1]. Igualmente, cuando se exponen a estímulos idénticos, las células se comportan frecuentemente de forma estocástica [1-7]. Ello significa que no puede asumirse que los datos obtenidos de una población de células reflejan el comportamiento de las células individuales. Se ha sugerido que las células pueden responder a estímulos mediante salvas de actividad transcripcional y que funcionan como un conmutador binario [4-9]; es decir en forma de todo o nada. Para determinar si dos transcritos se expresan en paralelo (expresión elevada al mismo tiempo) en anti-paralelo (una es alta cuando la otra es baja), se requiere realizar un análisis de la transcripción a nivel de células individuales. Cuando se analizan grupos de células al mismo tiempo, se pierde información importante. Por ejemplo, no es posible discriminar entre un pequeño cambio en la transcripción génica, que se produce en todas las células y grandes cambios en unas pocas células. Además, la heterogeneidad celular en los tejidos hace que el análisis de tipos celulares específicos sea dificultoso. Estos problemas se resuelven realizando determinaciones a nivel de células individuales. Una célula eucariota típica contiene aproximadamente 25 pg de ARN del cual menos del 2% es ARNm [10]. Ello corresponde a unos pocos centenares de miles de transcritos de ~10.000 genes que se expresan en cada célula en momento concreto. Las técnicas de imagen, tales como la hibridación in-situ fluorescente múltiplex (FISH), pueden monitorizar la actividad de transcripción génica dentro de una célula individual mediante el marcaje de ARNms específicos [3-4] y puede aplicarse a células vivas para proporcionar atisbos temporales de la complejidad de la maquinaria transcripcional. Se han determinado los niveles de proteínas en células individuales en bacterias [1, 7] y levaduras [6] utilizando proteínas informadoras fluorescentes. Para realizar un análisis completo del transcriptoma de una célula individual, se utilizan micromatrices (chips), precedidas de una amplificación no específica del ADNc. El método más ampliamente utilizado para el análisis del ARNm de células individuales es la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa RT-PCR (RT-PCR), y la RT-PCR en tiempo real cuantitativa (qRT-PCR) correspondiente. Esta técnica ofrece una sensibilidad, exactitud y rango dinámico superiores en comparación con métodos alternativos de determinación del ARNm [12-13]. El número de transcritos que puede analizarse fácilmente en las células individuales es pequeño, pero la amplificación previa del ADNc incrementa de forma importante este número [13-14]. Sin embargo, los protocolos para el análisis de células individuales existentes hasta el momento en la técnica solamente son útiles para la detección de dianas con un nivel elevado de expresión. Estos métodos no proporcionan la sensibilidad necesaria para detectar ARNms diana, cuyo nivel de expresión es comparativamente bajo. Descripción breve ES 2 365 447 T3 Por lo tanto, en un primer aspecto, la presente invención versa sobre un método para realizar una RT-PCR para amplificar un ARN diana que comprende las etapas de: a) lisis de una muestra biológica formada solamente por unas pocas células que se supone que contiene dicho ARN diana con un tampón de lisis que contiene entre 0,05 M y 1 M de agente Caotrópico b) diluir dicha muestra hasta un nivel tal que el agente Caotrópico se halle durante la etapa c) a una concentración de aproximadamente 10 a 60 mM c) sin ninguna etapa de purificación intermedia realizar la transcripción inversa de dicho ARN en presencia de una mezcla de cebadores de síntesis de ADNc de la primera cadena, estando formada dicha mezcla por cebadores que se hibridan a una secuencia poli-A y/o cebadores aleatorios d) someter dicha muestra a múltiples ciclos de un protocolo de termociclado y monitorizar la amplificación 2 ES 2 365 447 T3 de dicha primera cadena de ADNc en tiempo real. Este método es típicamente aplicable si la muestra comprende solamente un número limitado de células, es decir no más de 100 células, y preferentemente menos de 10 células. En concreto, el método es aplicable incluso si la muestra comprende solamente una sola célula. Preferentemente, la etapa a) se realiza durante al menos 5 minutos a una temperatura entre aproximadamente 75 ºC y 85 ºC. También preferentemente, dicho agente caotrópico es el tiocianato de guanidina. Alternativamente, dicho agente caotrópico puede seleccionarse del grupo formado por clorhidrato de guanidina, cianato potásico y sulfato amónico. En una realización importante, dicha muestra biológica está formada por no más de 100 células o preferentemente no más de 10 células. En una realización importante específica, dicha muestra biológica es una sola célula. Preferentemente, el tampón de lisis contiene entre aproximadamente 0,2 y 0,5 M de agente caotrópico. También preferentemente, durante la etapa c), es decir, durante la reacción de la transcriptasa inversa, el agente caotrópico se halla presente en una concentración de aproximadamente 10-60 mM, más preferentemente entre 30 y 50 mM y de forma más preferente aproximadamente 40 mM. Opcionalmente, la reacción de la transcriptasa inversa puede realizarse en presencia de 0,5 a 2% de NP 40. La etapa de incubación a) a una temperatura entre aproximadamente 75 ºC y 80 ºC puede realizarse en algunos casos en presencia de proteinasa K a las concentraciones descritas más adelante. Opcionalmente, la muestra se congela a una temperatura entre aproximadamente -20 ºC y -80 ºC entre las etapas a) y b). Según la presente invención es altamente preferente, que dicha mezcla de cebadores de síntesis de ADNc comprenda ambos: cebadores que se hibridan a una secuencia poli-A así como cebadores aleatorios. El cebador aleatorio es habitualmente un cebador hexámero aleatorio. Los cebadores que se hibridan a una secuencia poli-A son habitualmente cebadores oligo-dT u oligo-dU. En una realización preferente, dichos cebadores que se hibridan a una secuencia poli-A y los cebadores aleatorios están presentes en cantidades iguales. En otra realización preferente, que es compatible con la anterior, dichos cebadores que se hibridan a una secuencia poli-A y los cebadores aleatorios están ambos presentes a una concentración entre 1 µM y 5 µM. Son altamente preferentes concentraciones de aproximadamente 2,5 mM de ambos. En una realización muy específica, adecuada para el análisis de muestras biológica multicelulares, el método según la presente invención comprende las etapas de a) lisis de una muestra biológica que se supone que contiene dicho ARN diana con un tampón de lisis que contiene una concentración de tiocianato de guanidina entre 0,2 M y 1 M mediante - incubación durante al menos 5 minutos a una temperatura entre aproximadamente 55 ºC y 85 ºC en presencia o ausencia de proteinasa K - incubación entre aproximadamente 2 y 10 minutos a 95 ºC - congelación de dicha muestra a -25 ºC b) diluir dicha muestra hasta un nivel en el que el tiocianato de guanidina esté presente en una concentración de entre aproximadamente 20 y 60 mM c) realizar una transcripción inversa en presencia de una mezcla de cebadores de síntesis de ADNc de la primera cadena, estando formada dicha mezcla por cebadores de secuencia aleatoria y cebadores que se hibridan a una secuencia poli-A d) someter dicha muestra a múltiples ciclos de un protocolo de termociclado y monitorizar la amplificación de dicha primera cadena de ADNc en tiempo real. En otra realización muy específica adecuada para el análisis de células individuales, el método según la presente invención comprende las etapas de 3 a) lisis de una célula individual que se supone que contiene dicho ARN diana con un tampón de lisis que contiene una concentración de tiocianato de guanidina entre 0,2 M y 1 M mediante - incubación durante al menos 10 minutos a una temperatura entre aproximadamente 75 ºC y 85 ºC en presencia... [Seguir leyendo]

1. Método para realizar una RT-PCR para amplificar un ARN diana que comprende las etapas de a) lisar una muestra biológica que se supone que contiene dicho ARN diana con un tampón de lisis que contiene entre 0,05 M y 1 M de tiocianato de guanidina b) diluir dicha muestra hasta un nivel en el que la concentración de tiocianato de guanidina presente en la etapa c) sea aproximadamente entre 10 y 60 mM c) sin ninguna etapa intermedia de purificación, proceder a la transcripción inversa de dicho ARN diana en presencia de una mezcla de cebadores de síntesis de ADNc de la primera cadena, conteniendo dicha mezcla cebadores que se hibridan a una secuencia poli-A y/o cebadores aleatorios d) someter dicha muestra a múltiples ciclos de un protocolo de termociclado y monitorizar la amplificación de dicho ADNc de primera cadena en tiempo real, en el que dicha muestra biológica está formada por no más de 100 células, preferentemente no más de 10 células y de forma más preferente por una célula individual. 2. Método según la reivindicación 1, en el que dicho tampón de lisis comprende entre aproximadamente 0,2 M y 0,5 M de tiocianato de guanidina. 3. Método según las reivindicaciones 1 a 2, en el que durante la etapa c) el tiocianato de guanidina está presente en una concentración entre aproximadamente 30 y 50 mM, preferentemente aproximadamente 40 mM. 4. Método según las reivindicaciones 1 a 3, en el que la etapa c) se realiza en presencia de 0,5 % a 2 % de NP 40. 5. Método según las reivindicaciones 1 a 4, en el que la etapa a) se realiza durante al menos 5 minutos a una temperatura entre aproximadamente 75 ºC y 85 ºC. 6. Método según las reivindicaciones 1 a 5, en el que la incubación de la etapa a) a una temperatura entre aproximadamente 75 ºC y 85 ºC se realiza en presencia de proteinasa K. 7. Método según las reivindicaciones 1 a 6, en el que entre las etapas a) y b) la muestra se congela a temperaturas entre aproximadamente -20 ºC y -80 ºC. 8. Método según las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicha mezcla de síntesis de ADNc comprende cebadores que se hibridan a una secuencia poli-A y cebadores aleatorios. 9. Método según la reivindicación 8, en el que los cebadores que se hibridan a una secuencia poli-A y los cebadores aleatorios están presente en cantidades molares esencialmente iguales. 10. Método según las reivindicaciones 8 a 9, en el que dichos cebadores que se hibridan a una secuencia poli-A y dichos cebadores aleatorios se encuentran ambos presentes a una concentración entre 1 µM y 5 µM. 11. Método según la reivindicación 9, en el que dichos cebadores que se hibridan a una secuencia poli-A y dichos cebadores aleatorios se encuentran ambos presentes a una concentración de aproximadamente 2,5 µM. ES 2 365 447 T3 11 ES 2 365 447 T3 12 ES 2 365 447 T3 13 ES 2 365 447 T3 14 ES 2 365 447 T3