CONJUGADOS POLÍMEROS DE LA CAJA A DE HMGB1 Y VARIANTES DE LA CAJA A DE HMGB1.

Conjugado polímero del dominio de unión de alta afinidad Caja A de HMGB1 de tipo salvaje humano y/o no humano (Caja A de HMGB1) o de un fragmento biológicamente activo de la Caja A de HMGB1

La presente invención se refiere a nuevos conjugados polímeros del dominio de unión de alta afinidad Caja A de HMGB1 (Caja A de HMGB1) o de un fragmento biológicamente activo de la Caja A de HMGB1. Además, la invención se refiere a nuevos conjugados polímeros de variantes polipeptídicas del dominio de unión de alta afinidad Caja A de HMGB1 (Caja A de HMGB1) o de los fragmentos biológicamente activos de la Caja A de HMGB1. Además, la presente invención se refiere al uso de dichos conjugados polímeros para diagnosticar, prevenir, aliviar y/o tratar patologías asociadas con HMGB1 extracelular y/o asociadas con una expresión incrementada de RAGE.

La proteína HMGB1 pertenece a la familia de las proteínas del grupo de alta movilidad (HMG). Las proteínas del HMG, así denominadas debido a su elevada movilidad electroforética en geles de poliacrilamida, son las proteínas más ubicuas distintas de las histonas asociadas con cromatina aislada en las células eucariotas. Estas proteínas desempeñan un papel “arquitectónico” generalizado en la flexión, formación de bucles, plegamiento y envolvimiento del ADN, dado que distorsionan, flexionan o modifican estructuras y complejos de ADN con factores de transcripción

o histonas (Andersson et al., 2000; Agresti et al., 2003; Degryse et al., 2003). La proteína del grupo 1 de alta movilidad (HMGB1) es habitualmente un factor nuclear, en particular una molécula reguladora transcripcional que provoca la flexión del ADN y que facilita la unión de varios complejos transcripcionales.

Estructuralmente, la proteína HMGB1 es una proteína de aproximadamente 25 kDa con una secuencia altamente conservada entre los mamíferos, con lo que 2 de cada 214 aminoácidos tienen sustituciones conservativas en todas las especies de mamíferos. HMGB1 está presente de forma ubicua en todos los núcleos de los vertebrados, y en particular se puede encontrar en fibroblastos, neuronas, hepatocitos, gliocitos y en células derivadas de células madre hematopoyéticas, incluyendo monocitos/macrófagos, neutrófilos y plaquetas. La molécula de HMGB1 tiene una estructura tripartita compuesta de tres dominios distintos: dos dominios de unión a ADN, denominados Caja A y Caja B de HMG, y un término carboxilo ácido, que hace que la misma esté cargada bipolarmente.

Las dos cajas de HMGB están involucradas en la función de la proteína como elementos arquitectónicos de unión a ADN inespecíficos de la secuencia, confiriendo la capacidad para unirse a ADN en estructuras de ADN distorsionadas reconocidas y estabilizando el ensamblaje, la remodelación y el deslizamiento de nucleosomas. Ambas cajas A y B de HMG están formadas por 84 restos de aminoácidos muy conservados, están fuertemente cargados positivamente, y están dispuestas en tres hélices  que tienen un plegamiento similar en forma de L. La rama larga de la “L” contiene la hebra extendida N-terminal y la hélice III (Andersson et al., 2002; Agresti et al., 2003; Thomas, J.O. 2001), mientras que la rama corta comprende las hélices I y II. El análisis de la función estructural revela que el dominio de citosina proinflamatoria de HMGB1 es la Caja B, y en particular la secuencia de sus primeros 20 aminoácidos. La Caja A es un agonista extremadamente débil de la liberación de citosina proinflamatoria accionada por HMGB1, e inhibe competitivamente las actividades proinflamatorias de la Caja B y de toda la proteína. Por lo tanto, desde el punto de vista farmacológico, la Caja A actúa como un antagonista de las patologías inducidas y/o sostenidas por la Caja B y HMGB1.

El tercer dominio, el término carboxilo o cola ácida, está cargado muy negativamente, dado que contiene 30 restos repetitivos de ácido aspártico y glutámico, y está enlazado a las cajas por una región básica de alrededor de 20 restos. Las HMGB1 de ratón y de rata difieren de la forma humana sólo en dos sustituciones, que están localizadas en este tramo continuo C-terminal.

Además de su localización nuclear y su papel como regulador de factores de transcripción, HMGB1 se ha encontrado también en el medio extracelular, liberada activamente por células activadas del sistema inmunitario (monocitos y macrófagos), o liberada pasivamente por células deterioradas o necróticas (Andersson et al., 2002; Scaffidi et al., 2002; Bonaldi et al., 2002; Taniguchi et al., 2003; Friedman et al., 2003; Palumbo et al., 2004).

La HMGB1 liberada extracelularmente actúa como una citocina potente y como un factor estimulador de macrófagos extremadamente potente. HMGB1 actúa directamente uniéndose a la membrana celular, induciendo señalización y quimiotaxia, teniendo función semejante a una quimiocina (Yang et al., 2001) y actuando además indirectamente aumentando la expresión y secreción de citocinas pro-inflamatorias. Esto hace de la proteína HMGB1 extracelular una potente proteína quimiotáctica e inmunorreguladora que promueve una respuesta inmunitaria inflamatoria efectiva. Adicionalmente, otras proteínas pertenecientes a la familia de proteínas del HMG, y que son capaces de flexionar el ADN, se liberan junto con HMGB1 en el medio extracelular. Estas proteínas son, entre otras, HMGB2, HMGB3, HMG-1L10, MHG-4L y SP100-HMG. Comparten con HMGB1 secuencias de aminoácidos altamente homólogas. Al igual que HMGB1, desencadenan/sostienen patologías inflamatorias que interaccionan con los mismos receptores, conduciendo a las mismas rutas de interacción aguas abajo.

En células sanas, HMGB1 migra al citoplasma por transporte tanto pasivo como activo. Sin embargo, todas las células cultivadas y monocitos en reposo contienen la mayor proporción de HMGB1 en el núcleo, lo que indica que, en condiciones basales, la importación es mucho más eficaz que la exportación. Las células podrían transportar HMGB1 fuera del núcleo acetilando restos de lisina, que son abundantes en HMGB1, neutralizando de ese modo su carga básica y haciendo que los mismos sean incapaces de funcionar como señales de localización nucleares. La hiperacetilación de HMGB1 nuclear determina la relocalización de esta proteína desde el núcleo al citoplasma (en los fibroblastos, por ejemplo), o su acumulación en endolisosomas secretores (en monocitos y macrófagos activados, por ejemplo), y el redireccionamiento subsiguiente hacia la liberación por una ruta secretora no clásica mediada por vesículas. La secreción de HMGB1 por monocitos ya activados es desencadenada luego por la lisofosfatidilcolina (LPC) bioactiva, que es generada más tarde en el sitio de inflamación a partir de fosfatidilcolina por la acción de la fosfolipasa secretora sPLA2 producida por monocitos varias horas después de su activación. Por lo tanto, parece que la secreción de HMGB1 está inducida por dos señales (Bonaldi et al., 2003) y tiene lugar en tres etapas: 1) inicialmente, una señal inflamatoria promueve la acetilación de HMGB1 y su relocalización desde el núcleo al citoplasma (etapa 1) y el almacenamiento en vesículas citoplásmicas secretoras (etapa 2); a continuación, una señal de secreción (ATP extracelular o lisofosfatidilcolina) promueve la exocitosis (tercera etapa) (Andersson et al., 2002; Scaffidi et al., 2002; Gardella et al., 2002; Bonaldi et al., 2003; Friedman et al., 2003).

La HMGB1 liberada ha sido identificada como uno de los ligandos que se unen al receptor RAGE. Este receptor se expresa en la mayoría de los tipos de células, y a un nivel elevado, principalmente en células endoteliales, en células de la musculatura lisa vascular, en monocitos y macrófagos, y en fagocitos mononucleares. El reconocimiento implica el terminal C de HMGB1. La interacción de HMGB1 y RAGE desencadena un periodo sostenido de activación celular mediado por el aumento de RAGE y señalización dependiente de receptores. En particular, la interacción de HMGB1 y RAGE activa varias rutas de transducción de señales intracelulares, que incluyen proteína cinasas activadas por mitógenos (MAPK), Cdc-42, p21ras, Rac y el factor de translocación nuclear B (NF-B), el factor de transcripción ligado clásicamente a procesos inflamatorios (Schmidt et al., 2001).

De acuerdo con varias pruebas experimentales, la HMGB1 liberada puede interaccionar también con receptores pertenecientes a una o más subclases de la familia de los receptores de tipo Toll. Además, HMGB1 puede interaccionar también con el dominio semejante a lectina N-terminal funcional (D1) de trombomodulina. Debido a la capacidad del dominio D1 funcional de la trombomodulina para interceptar y unirse a HMGB1 circulante, se evita la interacción con los receptores RAGE y los receptores... [Seguir leyendo]

1. Conjugado polímero del dominio de unión de alta afinidad Caja A de HMGB1 de tipo salvaje humano y/o no humano (Caja A de HMGB1) o de un fragmento biológicamente activo de la Caja A de HMGB1.

2. Conjugado polímero de una variante polipeptídica del dominio de unión de alta afinidad Caja A de HMGB1 humano y/o no humano (Caja A de HMGB1) o de un fragmento biológicamente activo de la Caja A de HMGB1, por el que la secuencia de aminoácidos de dicha variante polipeptídica difiere de la secuencia de aminoácidos de la Caja A de HMGB1 de tipo salvaje por la mutación de uno o más aminoácidos individuales.

3. El conjugado polímero de la reivindicación 1 ó 2, en el que el polímero es un resto polimérico lineal o ramificado del grupo que consiste en polialquilenglicol, poli(óxido de alquileno), poli(ácido acrílico), poliacrilato, poliacrilamida o sus derivados N-alquílicos, poli(ácido metacrílico), polimetacrilato, poli(ácido etilacrílico), polietilacrilato, polivinilpirrolidona, poli(alcohol vinílico), poli(ácido glicólico), poli(ácido láctico), poli(ácido láctico-co-glicólico), dextrano, quitosano opoliaminoácido.

4. El conjugado polímero de la reivindicación 1 ó 2, en el que el polímero es un resto polimérico lineal o ramificado seleccionado de polietilenglicol (PEG) o metoxi-polietilenglicol (m-PEG), preferiblemente con un peso molecular medio de 20.000 o un peso molecular medio de 40.000 Da.

5. El conjugado polímero de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el resto polimérico está enlazado covalentemente al polipéptido de la Caja A de HMGB1, a la variante polipeptídica de la Caja A de HMGB1 o a un fragmento biológicamente activo de los mismos.

6. El conjugado polímero de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el sitio de conjugación en el polipéptido, variante polipeptídica o fragmento biológicamente activo de los mismos de la Caja A de HMGB1 se selecciona de un resto de lisina, cisteína, histidina, arginina, tirosina, serina, treonina, aspartato, y glutamato, o el grupo amino N-terminal.

7. El conjugado polímero de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la variante polipeptídica difiere de la secuencia de la Caja A de HMGB1 de tipo salvaje en la mutación de 1 a 10 aminoácidos individuales, preferiblemente en sólo un único aminoácido.

8. El conjugado polímero de la reivindicación 7, en el que la mutación es una sustitución, una supresión o una adición de aminoácidos individuales.

9. El conjugado polímero de la reivindicación 8, en el que la sustitución es una sustitución conservativa o una sustitución no conservativa obtenida mediante un aminoácido diferente codificado genéticamente o mediante aminoácidos no codificados genéticamente.

10. El conjugado polímero de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la variante polipeptídica de la Caja A de HMGB1 humana se selecciona del grupo que consiste en las secuencia de aminoácidos como se definen en cualquiera de las SEC ID NO: 2 a 116.

11. El conjugado polímero de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que los fragmentos biológicamente activos de la Caja A de HMGB1 de tipo salvaje humana es un fragmento de al menos 77 o al menos 54 aminoácidos respectivamente, y comprenden las secuencias de aminoácidos como se definen en SEC ID NO: 117 ó 223 respectivamente, y en el que la variante polipeptídica de dichos fragmentos biológicamente activos de la Caja A de HMGB1 humana se selecciona del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos como se definen en cualquiera de las SEC ID NO: 118 a 222 ó 224 a 300.

12. El conjugado polímero de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la Caja A de HMGB1 no humana es la Caja A de HMGB1 de Anopheles gambia (SEC ID NO: 301), y en el que la variante polipeptídica no humana de dicha Caja A de HMGB1 de Anopheles gambia se selecciona del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos como se definen en cualquiera de SEC ID NO: 302 a 418.

13. El conjugado polímero de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y 12, en el que los fragmentos biológicamente activos de la Caja A de HMGB1 de tipo salvaje de Anopheles gambia es un fragmento de al menos 77 o al menos 54 aminoácidos respectivamente y comprende las secuencias de aminoácidos como se definen en SEC ID NO: 419 ó 529 respectivamente, y en el que la variante polipeptídica de dichos fragmentos biológicamente activos de la Caja A de HMGB1 de Anopheles gambia se selecciona del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos como se definen en cualquiera de las SEC ID NO: 420 a 528 ó 530 a 610.

14. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva de al menos un conjugado polímero de cualquiera de las reivindicaciones anteriores como agente activo, y opcionalmente junto con vehículos, adyuvantes, diluyentes o/y aditivos farmacéuticamente aceptables.

15. La composición de la reivindicación 14 para aplicaciones de diagnóstico o para aplicaciones terapéuticas.

16. Uso de un conjugado polímero de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para la fabricación de un medicamento para la prevención, alivio o tratamiento de patologías asociadas con HMGB1 o patologías asociadas con las proteínas homólogas a HMGB1, particularmente seleccionadas de estados patológicos mediados por la activación de la cascada de citocinas inflamatorias.

17. El uso de la reivindicación 16, en el que los estados patológicos se seleccionan del grupo que consiste en enfermedad inflamatoria, enfermedad autoinmunitaria, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, lesión por reperfusión después de transplante de órganos, afecciones cardiovasculares, enfermedad obstétrica y ginecológica, enfermedad infecciosa (vírica y bacteriana), enfermedad alérgica y atópica, patologías de tumores sólidos y líquidos, enfermedades de rechazo de transplantes, enfermedades congénitas, enfermedades dermatológicas, enfermedades neurológicas, caquexia, enfermedades renales, condiciones de intoxicación iatrogénica, enfermedades metabólicas e idiopáticas, y enfermedades oftalmológicas.

18. Uso de un conjugado polímero de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para la fabricación de un medicamento para la prevención, alivio o tratamiento de patologías relacionadas con RAGE, en particular diabetes de tipo I y/o tipo II.

19. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18 en combinación con un agente adicional capaz de inhibir un mediador precoz de la cascada de citocinas inflamatorias, en el que el agente adicional se selecciona particularmente de

(i) un antagonista o inhibidor de una citocina seleccionada del grupo que consiste en TNF, IL-1, IL-1, IL-Ra, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13, IL-18, IFN-, MIP-1, MIF-1, MIP-2, MIF y PAF;

(ii) un anticuerpo contra RAGE, un ácido nucleico o un análogo de ácido nucleico capaz de inhibir la expresión de RAGE, por ejemplo una molécula antisentido, una ribozima o una molécula de interferencia de ARN, o una molécula sintética pequeña antagonista de la interacción de HMGB1 con RAGE o RAGE soluble (sRAGE);

(iii) un inhibidor de la interacción de un receptor de tipo Toll (TLR), en particular de TLR2, TLR4, TLR7, TLR8 o/y TLR9, con HMGB1, preferiblemente un anticuerpo monoclonal o policlonal, un ácido nucleico o un análogo de ácido nucleico capaz de inhibir la expresión de TLR, por ejemplo una molécula antisentido, una ribozima o una molécula de interferencia de ARN, o una molécula sintética que tiene un tamaño menor que 1000 Dalton.

20. La composición de la reivindicación 14, en la que el al menos un conjugado polímero está en combinación con el al menos un agente adicional como se define en la reivindicación 19.

21. Dispositivo médico revestido de forma reversible con al menos un conjugado polímero de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.